WO2010061017A1 - Uso de selenio para proteger a los peces de la intoxicación por microcistinas - Google Patents

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WO2010061017A1 PCT/ES2009/000545 ES2009000545W WO2010061017A1 WO 2010061017 A1 WO2010061017 A1 WO 2010061017A1 ES 2009000545 W ES2009000545 W ES 2009000545W WO 2010061017 A1 WO2010061017 A1 WO 2010061017A1
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selenium
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mcs
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Ana María CAMEÁN FERNÁNDEZ
Loyda Esther Atencio Genes
María PUERTO RODRÍGUEZ
Ana Isabel Prieto Ortega
Ángeles Mencía JOS GALLEGO
Isabel Moreno Navarro
Silvia PICHARDO SÁNCHEZ
M. Rosario Moyano Salvago
Alfonso BLANCO RODRÍGUEZ
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Universidad De Sevilla
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/20—Inorganic substances, e.g. oligoelements
    • A23K20/30—Oligoelements

Definitions

  • MCs microcystins
  • said composition in the present invention it refers to the use of a composition comprising Selenium for the treatment, prevention and / or recovery of toxic effects in fish exposed to microcystins (MCs). It also refers to the use of said composition in the recovery of the histopathological alterations produced in the tissues of the list comprising liver, kidney, heart, gills and / or gastrointestinal tract.
  • said composition is used for the manufacture of a functional food, a vitamin supplement, or a nutritional supplement.
  • Selenium is an essential micronutrient for animals and humans. In animals, different syndromes (growth disorders, muscle degeneration, cardiomyopathy, liver degeneration, etc.) have been described due to their deficiency. In veterinary medicine there is a wide prophylactic and therapeutic use of sodium selenite salt, often in combination with vitamin E, against various diseases related to deficiencies of both nutrients. The recommended doses of sodium selenite vary between 0.01-0.08 mg Se 4+ / kg weight (0.25-1.5 mg / kg feed) in preparations intended for medicated feed for horse, cow and sheep, as well as in chickens and pigs. (EMEA / MRL249 / 97 final, 1997). Sodium selenium and selenium have been approved as food additives at a maximum concentration of 0.5 mg Se per Kg of feed.
  • the main mechanism of action of the physiological and pharmacological effects of Selenium is based on its antioxidant effect of cell membranes against hydrogen peroxide, lipoperoxides and reactive oxygen species (ROS) in general.
  • the effects are related to the enzymatic activity of the enzyme Glutathione Peroxidase (GPx), which contains selenocysteine, specifically four subunits and each one contains a Selenium atom (Batcioglu K et al. (2002) CeII Biochem Funct 20: 115 - 118).
  • MCs are toxins produced by toxic cyanobacteria present in surface waters, which can bioaccumulate in fish for public consumption at levels very close to and even higher than the established provisional Tolerable Daily Intake (RTD), affecting the quality and safety of this type of food and assuming a potential risk for the consumer.
  • RTD Tolerable Daily Intake
  • MCs have caused episodes of mass death in fish, being responsible for the disease called "NetPen Liver Disease” (NPLD) in salmon from the Atlantic bred in captivity.
  • NPLD Network Liver Disease
  • fish are less sensitive to toxic effects, which could allow a greater accumulation, there being variability depending on the species and highlighting its greater distribution because they affect not only the liver but also the kidney, heart, gills , skin, marrow and blood, also altering behavior and development.
  • Cyanobacteria are part of the diet of various cyprinids and cichlids, as is the case of the fish species to which this invention applies, mainly Tilapias (Orechromis, sp.). Tilapia (Oreochromis sp.) Is one of the most rapidly introduced fish in aquaculture, due to the ease of handling, great adaptability to adverse conditions and easy reproduction; its different varieties are filters and consumers of cyanobacteria and in Europe a great interest in its cultivation is awakening. As a more accepted toxic mechanism of action, MCs at the subcellular level are specific inhibitors of protein phosphatases type 1 (PP1) and 2A (PP2A), triggering a process of apoptosis and consequent cell damage. On the other hand, oxidative stress plays a very significant role in the pathogenicity of these toxins, detecting an increase in the production of reactive oxygen species (ROS), as well as changes in the activity of various antioxidant enzymes in rodents and fish.
  • ROS reactive oxygen
  • the present invention relates to the use of a composition comprising Selenium for the treatment, prevention and / or recovery of toxic effects in fish exposed to MCs.
  • tilapia (Oreochromis sp.) Exposed to single and repeated doses of MCs oxidative stress and pathological alterations are induced. Specifically, dose-dependent variations in the activity of various antioxidant enzymes, decreased levels of Glutathione (GSH), increased levels of lipoperoxidation (LPO) and protein oxidation have been found in different organs (liver, kidney) , gills, etc.), and multiple histopathological alterations in various organs such as liver, kidney, gills or heart. Selenium administered in the present invention is shown to be effective in maintaining the health status of the fish, preventing damage caused by toxins and / or improving the toxic effects induced by MCs in various organs of intoxicated tilapia.
  • Glutathione Glutathione
  • LPO lipoperoxidation
  • protein oxidation protein oxidation
  • Selenium administered in the present invention is shown to be effective in maintaining the health status of the fish, preventing damage caused by toxins and / or
  • LPO lipoperoxidation
  • a first aspect of the present invention refers to the use of a composition comprising Selenium for the preparation of a medicament useful in the treatment, prevention and / or recovery of toxic effects in fish exposed to MC.
  • the composition of the present invention comprises, at least, Selenium and the medicament is composed, at least, of the previous composition.
  • Selenium, its salts, pharmaceutically acceptable derivatives or its prodrugs are formulated in an appropriate pharmaceutical composition, in the therapeutically effective amount, together with one or more pharmaceutically acceptable carriers, adjuvants or excipients.
  • the medicine is used to treat toxic effects in fish exposed to MC.
  • a “pharmaceutically acceptable derivative” is meant any pharmaceutically acceptable salt or any other compound that, after administration, is capable of providing (directly or indirectly) Selenium.
  • the salt of Selenium is sodium selenite (Na 2 Se ⁇ 3 .5H 2 O).
  • a “pharmaceutically acceptable vehicle” refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical administration forms and includes solids or liquids, solvents, surfactants, etc.
  • treatment as understood in the present invention is to combat toxic effects to stabilize the toxicity status of individuals.
  • the medicine is also used for the prevention of toxic effects caused to fish exposed to MCs.
  • prevention as understood in the present invention is to avoid the appearance of toxic effects in fish exposed to MCs. In this case, prior to the poisoning by MCs 1, the fish are protected by an increase in the antioxidant defenses produced by the action of Selenium. The medicine is also used for the recovery of toxic effects caused in fish exposed to MC.
  • toxic effects refers to the consequence derived from the exposure of the fish to the MC toxin, that is, the appearance of various adverse effects such as cell damage that causes damage in biological tissues, which in turn can cause a change in physiological functions and cell metabolism.
  • MCs are toxins of heptapeptide structure produced by both filamentous cyanobacteria (Anabaena, Oscillatoria, Nostoc, Hapalosiphon) and colonial (Micnocystis). Once ingested, the MCs are transported to the liver where most are stored and the rest remain in the blood and can contaminate other tissues. MCs covalently bind to protein phosphatases thereby blocking numerous cell control processes.
  • the MC of the present invention is selected from the list comprising LA microcystin, LR microcystin, YR microcystin, RR microcystin, YM microcystin, YA microcystin, LY microcystin, FR microcystin, Laba microcystin, HtyR microcystin, AR microcystin, M (O ) R, microcystin WR, 3-desmethylmicrocystin LR, 7-demethylmicrocystin LR, 3,7-didesmethylmicrocystin LR, 3-desmethylmicrocystin YR, 7-demethylmicrocystin YR, 3- demethylmicrocystin RR, 7-demethylmicrocystine, 3-RR-methylcyccyrocystrocystrocystrocystrocystrocystrocystrocystroc
  • a second aspect of the present invention is the use of a composition comprising Selenium for the preparation of a medicament useful in the recovery of toxic effects in fish exposed to MCs.
  • the term "recovery” refers to the disappearance of the toxic effects caused by the poisoning with MCs. This recovery involves the total reversal of the damage caused to the tissues of the fish, thus recovering the normal functions of the affected organs.
  • An even more preferred embodiment of the present invention comprises the use of a composition containing Selenium for the preparation of a medicament useful in the recovery of the histopathological alterations produced in the tissues of the list comprising liver, kidney, heart, gills and / or gastrointestinal tract.
  • MCs can accumulate in liver tissue and can also reach other organs using blood as a means of dispersion, in this way, MCs can cause toxic effects and / or histopathological alterations in said organs.
  • the recovery of the tissues affected by the histopathological alterations is a remarkable aspect of the present invention since it can involve the healing of cultured fish, fish selected for various characteristics for breeding, fish of endangered species or any other type of fish that presents histopathological alterations in a reversible degree.
  • the recovery that occurs in the histopathological alterations in some organs consists of: - Liver: the MCs produce a disorganization of the hepatic parenchyma, observing hepatocytes with very clear cytoplasms and the cell contour as a cell in onion, and structurally it is observed that they have cytoplasm with few organoids and cytoplasm filled with granular glycogen.
  • the hepatic cords are normal, hepatocytes with normal polyhedral morphology, with normal cytoplasmic organoids and absence of granular glycogen.
  • Kidney the glomerulopathy and glomerular atrophy evident, produced by the intoxication with MCs. With the administration of selenium glomeruli are observed with apparently normal fenestrated capillaries.
  • MCs induce partial myofibrolysis, edema and microhemorrhages, which are overcome by the higher dose of setenium (see below).
  • MCs induce a generalized hyperemia, which is reversed by Setenium.
  • Setenium is administered in a daily amount of between 1, 5 and 6 ⁇ g of Setenium per g of diet (equivalent to a daily amount of between 5 and 20 ⁇ g of sodium selenite per g of diet). This administration is carried out for at least one week. Preferably, the daily amount incorporated into the fish is between 3 and 6 ⁇ g of Setenium per g of diet. As the inventors have determined, the administration of daily amounts greater than 6 ⁇ g of Setenium per g of diet may cause alterations in the baseline values of certain biomarkers of oxidative stress (Catalase in kidney and the GSH / GSSG ratio in liver) induce LPO and protein oxidation in non-poisoned fish.
  • certain biomarkers of oxidative stress Catalase in kidney and the GSH / GSSG ratio in liver
  • composition can be administered in different ways, including, but not limited to, intraperitoneally, orally, orally, intramuscularly or subcutaneously. More preferably it is administered orally or intraperitoneally. In another more preferred embodiment, the composition is presented in a form adapted to oral or intraperitoneal administration.
  • Intoxicated fish are exposed to more than 60 ⁇ g of MC per fish and per day for 21 days (subchronic poisoning). Preferably the fish are exposed to more than 120 ⁇ g of MC per fish in single exposure.
  • excipient refers to a substance that helps the absorption of the active substance (in the present invention, Selenium), stabilizes said active substance or helps the preparation of the drug in the sense of giving consistency or providing flavors that make it more enjoyable
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together, such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, coloring function, protection function of the medicine such as to isolate it from air and / or moisture, function filling a tablet, capsule or any other form of presentation such as dibasic calcium phosphate, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption in the intestine without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • pharmaceutically acceptable excipient refers to the excipient being allowed and evaluated so as not to cause damage to the organisms to which it is administered.
  • the composition also comprises another active substance.
  • composition of the present invention can be presented in the form of solutions or any other form of clinically permitted administration and in a therapeutically effective amount.
  • Selenium can be part of a functional food, vitamin supplement, nutritional supplement or any combination thereof.
  • a functional food fulfills a specific function such as that of improving the health of the fish.
  • a vitamin supplement and / or nutritional supplement can be added to the functional food.
  • the functional food, the supplements described or Any of its combinations can be administered together with a feed, be part of the composition of the feed or can be administered independently.
  • the fish are cultured.
  • "farmed fish” means those fish raised in fish farms, ponds or any container of water of any size that allows the breeding of fish and / or fattening.
  • Cultivated fish can be, without limitation, fish intended for feeding or the breeding of ornamental fish.
  • the fish belong to the genus Omochromis sp.
  • the fish are selected, without limitation, from the list comprising O. amphimelas, O. andersonii ,, O. angolensis, O. aureus, O. chungruruensis, O. esculentus, O. hunteri, O. ismailiaensis, O. jipe, O. karomo, O. karongae, O. korogwe, O. lepidurus, O. leucostictus, O. lidole, O. macrochir, O. malagarasi, O. mortimer ⁇ , O. mossambicus, O. mweruensis, O. niloticus (NiIe tilapia), O.
  • Pantani O. pangani gir ⁇ gan, O. pangani pantani, O. placidus, O. placidus placidus, O. placidus ruvumae, O. rukwaensis, O. saka, O. salinicola, O. schwebischi, O. shiranus, O. shiranus chilwae , O. shiranus shiranus, O. spilurus, O. spilurus niger, O. spilurus percivali, O. spilurus spilurus, O. squamipinnis, O. tanganicae, O. upembae, O.
  • the fish belong to the species O. niloticus (NiIe tilapia).
  • FIG 1. Shows the protective effect of different doses of Selenium (sodium selenite) on MC-induced liver lesions in tilapia exposed to 120 ⁇ g MC / fish (single dose).
  • C Disorganized hepatic parenchyma, hepatocytes with very clear cytoplasms and cell contour as a cell in onion (arrow).
  • D The hepatocyte has a normal dense nucleus (N) surrounded by a cytoplasm with few organoids and the rest of the cytoplasm filled with granular glycogen (circle);
  • E Parenchyma with few hepatocytes with glycogenic degeneration without showing the cell morphology in onion (arrow).
  • F Parenchyma with few hepatocytes with glycogenic degeneration without showing the cell morphology in onion (arrow).
  • G Hepatocytes with greater development of cytoplasmic organoids (circle).
  • G Fish exposed to MC + Selenium medium dose (3.0 ⁇ g Se / g diet).
  • G Normal hepatic cords and H. Detail of normal hepatocyte with cytoplasmic organoids, reticles (R), mitochondria (star), lysosomes (arrow) and absence of granular glycogen.
  • FIG. 2 It shows the protective effect of different doses of Selenium (sodium selenite) on renal lesions induced by MCs in tilapia exposed to 120 ⁇ g MC / fish (single dose).
  • A, C, E, G Hematoxylin-eosin staining. 100 ⁇ m bars.
  • B, D, F, H Ultrastructural observations (electron microscopy). Bars 10, 10, 10, 5 ⁇ m.
  • A, B control fish;
  • C, D tilapia exposed only to MCs (120 ⁇ gMC / fish.).
  • C Glomerulopathy and evident glomerular atrophy (circle), represented by a loss in size, intraglomerular hyalinizations and loss of capillaries.
  • E 1 F Fish exposed to MC + Selenium low dose (1.5 ⁇ gSe / g diet).
  • F. Capillaries fenestrated with the wall of the endothelium (1), basal membrane (2) and practically normal podocytes (3) and remains of swollen endothelium (circle).
  • G 1 H Fish exposed to MC + Selenium medium dose (3.0 ⁇ g Se / g diet).
  • FIG. 3 It shows the protective effect of different doses of Selenium (sodium selenite) on heart lesions induced by MCs in tilapia exposed to 120 ⁇ g MC / fish (single dose).
  • G Fish exposed to MC + Selenium medium dose (3.0 ⁇ g Se / g diet).
  • G Dim myofibrolysis (arrow). Slightly edematous areas and scarce microhemorrhages.
  • H Abundant myofibrils (arrow) and abundant mitochondria (circle).
  • FIG. 4. It shows the protective effect of different doses of Selenium (sodium selenite) on gastrointestinal tract lesions induced by MCs in tilapia exposed to 120 ⁇ g MC / fish (single dose).
  • A, C, E, G Hematoxylin-eosin staining. Bars 50, 50, 100, 100 ⁇ m.
  • B 1 D, F, H Ultrastructural observations (electron microscopy). Bars 20, 10, 20, 20 ⁇ m (A, B) control fish;
  • C, D Tilapia exposed only to MCs (120 ⁇ g MC / fish).
  • C Shortening of the intestinal villi with necrosis in the apical zone (circle).
  • the invention was carried out using a total of 64 male fish of Orechromis niloticus (NiIe tilapia), of average weight 50 ⁇ 7 g, and length of 12 ⁇ 2 cm, obtained in a fish farm, and transferred in aquariums (96 L) with adequate water filtration and aeration system, and 12/12 h light / dark cycles.
  • the fish were fed commercial food (Dibaq, Segovia, Spain), in an amount of 0.3 g / day.
  • the fish were acclimatized for 15 days before the experiment.
  • the extraction of the MCs was carried out from a lyophilisate of cyanobacterial cells from a natural bloom containing 2885 ⁇ g / g of MC-LR, according to the method of Moreno et al (2004, Biol Res 37: 405- 417). 8 experimental groups with 8 animals were used in each. Each group was introduced in an independent aquarium: Aquarium 1: control fish, fed only with normal feed for 7 days. Aquarium 2: fish fed with feed for 7 days, intoxicated with MCs in the diet (single dose of 120 ⁇ g / fish).
  • Aquariums 3, 5 and 7 Fish fed with feed + Sodium Selenite (equivalent to 1.5, 3.0 or 6.0 ⁇ g Selenium / g diet, respectively) for 7 days.
  • Aquariums 4, 6 and 8 Fish with feed + Se (1.5, 3.0 or 6.0 ⁇ g Selenium / g diet, respectively) for 7 days. The fish are infected with a single dose of 120 ⁇ g MC / fish.
  • FIG 1 shows the glycogenic degeneration of the liver produced by the MCs, the hepatocytes showing a contom of cells in onion.
  • the lower dose of Selenium (1.5 ⁇ g Selenium / g diet) did not recover this degeneration, although it was less severe, while the intermediate and high doses recover the hepatic parenchyma architecture, with polyhedral hepatocytes.
  • FIG 2 shows the degenerative changes induced by MCs in the kidney: glomerular atrophy, glomerulopathy, greasing of the basal membranes and collapsed fenestrated capillaries. A total recovery of these lesions is achieved with the supplementation of 6.0 ⁇ g Selenium / g diet.

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Abstract

En la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende Selenio para el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a microcistinas (MCs). También se refiere al uso de la citada composición en la recuperación de las alteraciones histopatológicas producidas en los tejidos de la lista que comprende hígado, riñón, corazón, branquias y/o tracto gastrointestinal. Además, dicha composición se utiliza para la fabricación de un alimento funcional, un complemento vitamínico, o un complemento nutricional.

Description

Uso de Selenio para proteger a los peces de Ia intoxicación por microcistinas
En Ia presente invención se refiere al uso de una composición que comprende Selenio para el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a microcistinas (MCs). También se refiere al uso de Ia citada composición en Ia recuperación de las alteraciones histopatológicas producidas en los tejidos de Ia lista que comprende hígado, riñon, corazón, branquias y/o tracto gastrointestinal. Además, dicha composición se utiliza para Ia fabricación de un alimento funcional, un complemento vitamínico, o un complemento nutricional.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
El Selenio es un micronutriente esencial para animales y humanos. En animales se han descrito diferentes síndromes (alteraciones del crecimiento, degeneración muscular, cardiomiopatía, degeneración hepática, etc.) motivados por su deficiencia. En medicina veterinaria existe un amplio uso profiláctico y terapéutico de Ia sal selenito sódico, a menudo en combinación con Ia vitamina E, frente a diversas enfermedades relacionadas con las deficiencias de ambos nutrientes. Las dosis recomendadas de selenito sódico varían entre 0,01-0,08 mg Se4+/Kg peso (0,25-1 ,5 mg/Kg pienso) en las preparaciones destinadas a piensos medicados para caballo, vaca y oveja, así como en pollos y cerdos. (EMEA/MRL249/97 final, 1997). Selenito y seleniato sódicos han sido aprobados como aditivos alimentarios a una concentración máxima de 0,5 mg Se por Kg de pienso.
El mecanismo principal de acción de los efectos fisiológicos y farmacológicos del Selenio se basa en su efecto antioxidante de las membranas celulares frente a peróxido de hidrógeno, lipoperóxidos y a especies reactivas de oxígeno (ROS) en general. Los efectos están relacionados con Ia actividad enzimática de Ia enzima Glutatión Peroxidasa (GPx), que contiene selenocisteina, en concreto cuatro subunidades y cada una de ellas contiene un átomo de Selenio (Batcioglu K et al. (2002) CeII Biochem Funct 20:115- 118). También es un componente integral de otras proteínas funcionales, como por ejemplo tetra- iodotironina-5'-l-deiodinasa, que interviene en el metabolismo de hormonas tiroideas y tioredoxina reductasa, involucrada en Ia síntesis de ADN1 defensa frente estrés oxidativo y reparación de proteínas. Su acción protectora antioxidante se ha descrito en el documento WO2006018294-A1 , junto con Ia vitamina E.
En peces se ha empleado el selenito sódico como aditivo alimentario en piensos, para mejorar Ia eficiencia de piensos vegetales (JP61146155-A). El Selenio mejora las defensas antioxidantes fisiológicas en trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) (Miller LL et al. (2007) Aαuat Toxicol 83:263-271). Asimismo el Selenio se ha utilizado en combinación con cobre para mejorar Ia respuesta de los animales al estrés oxidativo (Lin Yu-Hung y Shiau Shi- Yen (2007) International Svmposium on Fish Nutrition and Feeding 267: 38- 43).
Por otro lado, las MCs son toxinas producidas por cianobacterias tóxicas presentes en aguas superficiales, que pueden bioacumularse en pescados de consumo público a niveles muy próximos e incluso superiores a Ia Ingesta Diaria Tolerable (IDT) provisional establecida, afectando a Ia calidad y seguridad de este tipo de alimentos y suponiendo un riesgo potencial para el consumidor. Las MCs han ocasionado episodios de muerte masiva en peces, siendo responsables de Ia enfermedad denominada "NetPen Liver Disease" (NPLD) en salmones procedentes del Atlántico criados en cautividad. En comparación con los mamíferos, los peces son menos sensibles a los efectos tóxicos, Io que podría permitir una mayor acumulación, existiendo variabilidad en función de Ia especie y destacando su mayor distribución pues afectan no sólo al hígado sino también al riñon, corazón, branquias, piel, médula y sangre, alterando además el comportamiento y el desarrollo. Las cianobacterias constituyen parte de Ia dieta de diversos ciprínidos y cíclidos, como es el caso de las especies de peces a las que se aplica esta invención, principalmente Tilapias (Orechromis, sp.). La Tilapia (Oreochromis sp.) es uno de los pescados que más rápidamente se ha introducido en acuicultura, por Ia facilidad que presenta su manejo, gran capacidad de adaptación a condiciones adversas y fácil reproducción; sus distintas variedades son filtradoras y consumidoras de cianobacterias y en Europa se está despertando un gran interés por su cultivo. Como mecanismo de acción tóxica más aceptado, las MCs a nivel subcelular son inhibidores específicos de las fosfatasas de proteínas tipo 1 (PP1) y 2A (PP2A), desencadenando un proceso de apoptosis y consecuente daño celular. Por otro lado, el estrés oxidativo juega un papel muy significativo en Ia patogenicidad de estas toxinas, detectándose un aumento en Ia producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), así como cambios en Ia actividad de diversas enzimas antioxidantes en roedores y peces.
Actualmente no existe un tratamiento antidótico específico en casos de intoxicación por MCs procedentes de cianobacterias. Varios estudios han demostrado los efectos protectores de ciertos antioxidantes frente a su acción tóxica en roedores, cuando se administran previamente a Ia exposición de las toxinas, como es Ia suplementación con Ia vitamina E, Ia vitamina C, licopenos, ciertos polifenoles del té, flavonoides o melatonina.
Hasta Ia fecha no se conoce ningún tratamiento capaz de recuperar a los peces intoxicados con MCs. Teniendo en cuenta Ia ubicuidad de estas toxinas se hace necesario recuperar peces que presenten alteraciones histopatológicas con diferentes niveles de afección que pueden impedir el ciclo de vida normal de los peces afectados.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al uso de una composición que comprende Selenio para el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a MCs.
En tilapias (Oreochromis sp.) expuestas a dosis únicas y repetidas de MCs se inducen estrés oxidativo y alteraciones patológicas. En concreto, se han comprobado variaciones dosis-dependiente en Ia actividad de diversas enzimas antioxidantes, disminución de los niveles de Glutatión (GSH), aumento de los niveles de lipoperoxidación (LPO) y de oxidación de proteínas, en diferentes órganos (hígado, riñon, branquias, etc.), y múltiples alteraciones histopatológicas en órganos diversos como hígado, riñon, branquias o corazón. El selenio administrado en Ia presente invención se muestra efectivo manteniendo el estado de salud del pez, previniendo daños causados por las toxinas y/o mejorando los efectos tóxicos inducidos por MCs en diversos órganos de tilapias intoxicadas.
El uso de Selenio como aditivo alimentario no solo mejora los niveles de GSH hepáticos, sino que por su propia actividad antioxidante es capaz de disminuir Ia lipoperoxidación (LPO) (hígado, riñon), aumentar el contenido proteico en hígado y recuperar las lesiones histopatológicas inducidas en múltiples órganos como hígado, riñon, corazón, tracto gastrointestinal y/o branquias.
En este sentido, un primer aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de una composición que comprende Selenio para Ia elaboración de un medicamento útil en el tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a MC.
La composición de Ia presente invención comprende, al menos, Selenio y el medicamento está compuesto, al menos, por Ia composición anterior. De esta forma, el Selenio, sus sales, derivados farmacéuticamente aceptables o sus profármacos, se formulan en una composición farmacéutica apropiada, en Ia cantidad terapéuticamente efectiva, junto con uno o más vehículos, adyuvantes o excipientes farmacéuticamente aceptables. El medicamento se emplea para el tratamiento de los efectos tóxicos en peces expuestos a MC.
Por un "derivado farmacéuticamente aceptable" se entiende cualquier sal, farmacéuticamente aceptable o cualquier otro compuesto que después de su administración, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) Selenio. Preferiblemente Ia sal de Selenio es selenito sódico (Na2Seθ3.5H2O).
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en Ia elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye sólidos o líquidos, disolventes, tensioactivos, etc. El término "tratamiento" tal como se entiende en Ia presente invención supone combatir los efectos tóxicos para estabilizar el estado de toxicidad de los individuos. El medicamento se emplea también para Ia prevención de los efectos tóxicos ocasionados a los peces expuestos a MCs. El término "prevención" tal como se entiende en Ia presente invención consiste en evitar Ia aparición de efectos tóxicos en peces expuestos a MCs. En este caso, previamente a Ia intoxicación por MCs1 los peces están protegidos por un aumento de las defensas antioxidantes producidos por Ia acción del Selenio. El medicamento también se emplea para Ia recuperación de los efectos tóxicos ocasionados en peces expuestos a MC.
El término "efectos tóxicos" tal como se entiende en Ia presente invención hace referencia a Ia consecuencia derivada de Ia exposición del pez a Ia toxina MC, es decir, Ia aparición de diversos efectos adversos como por ejemplo un daño celular que ocasiona un daño en los tejidos biológicos Io que a su vez puede provocar un cambio en las funciones fisiológicas y en el metabolismo celular.
Las MCs son toxinas de estructura heptapeptídica producidas tanto por cianobacterias filamentosas (Anabaena, Oscillatoria, Nostoc, Hapalosiphon) como coloniales (Micnocystis). Una vez que se ingieren, las MCs se transportan hasta el hígado donde Ia mayoría quedan almacenadas y el resto permanecen en Ia sangre y pueden contaminar otros tejidos. Las MCs se unen covalentemente a fosfatasas de proteínas bloqueando así numerosos procesos de control celular. La MC de Ia presente invención se selecciona de Ia lista que comprende microcistina LA, microcistina LR, microcistina YR, microcistina RR, microcistina YM, microcistina YA, microcistina LY, microcistina FR, microcistina Laba, microcistina HtyR, microcistina AR, microcistina M(O)R, microcistina WR, 3-desmetilmicrocistina LR, 7-desmetilmicrocistina LR, 3,7-didesmetilmicrocistina LR, 3-desmetilmicrocistina YR, 7-desmetilmicrocistina YR, 3- desmetilmicrocistina RR, 7-desmetilmicrocistina RR, 3,7-didesmetilmicrocistina RR, 3-desmetilmicrocistina HtyR, 7-desmetilmicrocistina HtyR, 3,7- didesmetilmicrocistina HtyR, 7-desmetilmicrocistina HphR, (Mser7)microcistina LR, (Ser7)microcistina LR, (Ser7)microcistina RR, (Ser7)microcistina HtyR, (Ser7)3-desmethytmicrocistina XR, (DMAdda) microcistina LR, (ADMAdda) microcistina LR, (ADMAdda)3-desmetilmicrocistina LR, (ADMAdda) microcistina Lhar, (ADMAdda,Mser7) microcistina LR, D-Glu(CH3O)estermicrocistina LR, D- Glu(CH3O)ester 3-desmetilmicrocistina LR, D-Glu(C3H702)ester microcistina LR o (D-SeM .ADMAdda) microcistina LR. La lista anterior no se limita a las MCs mencionadas. Preferiblemente Ia MC es microcistina LR (MC-LR).
Un segundo aspecto de Ia presente invención es el uso de una composición que comprende Selenio para Ia elaboración de un medicamento útil en Ia recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a MCs. El término "recuperación" hace referencia a Ia desaparición de los efectos tóxicos causados por Ia intoxicación con MCs. Esta recuperación supone Ia reversión total de los daños causados en los tejidos del pez, recuperando de esta forma las funciones normales de los órganos afectados.
Una realización aún más preferida de Ia presente invención comprende el uso de una composición que contiene Selenio para Ia elaboración de un medicamento útil en Ia recuperación de las alteraciones histopatológicas producidas en los tejidos de Ia lista que comprende hígado, riñon, corazón, branquias y/o tracto gastrointestinal. Tal como se ha mencionado anteriormente las MCs pueden acumularse en el tejido hepático y también pueden llegar a otros órganos utilizando Ia sangre como medio de dispersión, de esta forma, las MCs pueden causar efectos tóxicos y/o alteraciones histopatológicas en los citados órganos. La recuperación de los tejidos afectados por las alteraciones histopatológicas es un aspecto destacable de Ia presente invención ya que puede suponer Ia curación de los peces cultivados, peces seleccionados por diversas características para Ia cría, peces de especies en peligro de extinción o cualquier otro tipo de pez que presente alteraciones histopatológicas en un grado reversible.
La recuperación que se produce en las alteraciones histopatológicas en algunos órganos consiste en: - Hígado: las MCs producen una desorganización del parénquima hepático, observándose hepatocitos con citoplasmas muy claros y el contorno celular a modo de célula en cebolla, y estructuralmente se observa que poseen citoplasma con escasos organoides y citoplasma repleto de glucógeno granular.
Mediante Ia administración de Selenio se consigue que los cordones hepáticos sean normales, hepatocitos con morfología poliédrica normal, con organoides citoplasmáticos normales y ausencia de glucógeno granular. - Riñon: se recupera Ia glomerulopatía y atrofia glomerular evidentes, producida por Ia intoxicación con MCs. Con Ia administración de selenio se observan glomérulos con los capilares fenestrados aparentemente normales.
- Corazón: Las MCs inducen miofibrolisis parcial, edema y microhemorragias, que son superados por Ia dosis más elevada de setenio (ver más adelante).
- Intestino: El tratamiento con setenio recupera Ia pérdida, prácticamente total, de microvellosidades producidas por las MCs, apareciendo los enterocitos aparentemente normales y abundantes células calciformes.
- Branquias: Las MCs inducen una hiperemia generalizada, que es revertida por Setenio.
En una realización más preferida de Ia presente invención, el Setenio se administra en una cantidad diaria de entre 1 ,5 y 6 μg de Setenio por g de dieta (equivale a una cantidad diaria de entre 5 y 20 μg de selenita sódico por g de dieta). Esta administración se lleva a cabo durante al menos una semana. Preferiblemente Ia cantidad diaria incorporada a los peces es de entre 3 y 6 μg de Setenio por g de dieta. Tal como los inventores han determinado, Ia administración de cantidades diarias superiores a 6 μg de Setenio por g de dieta, pueden ocasionar alteraciones de los valores básales de ciertos biomarcadores de estrés oxidativo (Catalasa en riñon y Ia relación GSH/GSSG en hígado) e inducir LPO y oxidación de proteínas en peces no intoxicados.
Esta composición, se puede administrar de distintas formas, entre ellas, pero sin limitarse, intraperitonealmente, oralmente, bucalmente, intramuscularmente o de forma subcutánea. Más preferiblemente se administra de forma oral o intraperitoneal. En otra realización más preferida Ia composición se presenta en una forma adaptada a Ia administración oral o intraperitoneal.
Los peces intoxicados están expuestos a más de 60 μg de MC por pez y por día durante 21 días (intoxicación subcrónica). Preferiblemente los peces están expuestos a más de 120 μg de MC por pez en exposición única.
Otra realización preferida de Ia invención, comprende el uso de Ia composición descrita, que además incluye excipientes farmacológicamente aceptables. El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a Ia absorción de Ia sustancia activa (en Ia presente invención, Selenio), estabiliza dicha sustancia activa o ayuda a Ia preparación del medicamento en el sentido de darle consistencia o aportar sabores que Io hagan más agradable. Así pues, los excipientes podrían tener Ia función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o Ia humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar Ia disolución de los componentes y su absorción en el intestino sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
El término excipiente "farmacológicamente aceptable" hace referencia a que el excipiente esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.
En una realización más preferida de Ia invención, Ia composición comprende además otra sustancia activa.
En cada caso Ia composición se adaptará al tipo de administración utilizada, por ello, Ia composición de Ia presente invención se puede presentar bajo Ia forma de soluciones o cualquier otra forma de administración clínicamente permitida y en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Otras realizaciones preferidas son el uso para Ia fabricación de un alimento funcional, el uso para Ia fabricación de un complemento vitamínico y otra más es el uso para Ia fabricación de un complemento nutricional.
El Selenio puede formar parte de un alimento funcional, complemento vitamínico, complemento nutricional o cualquiera de sus combinaciones. Tal como se entiende en Ia presente invención, un alimento funcional cumple una función específica como puede ser Ia de mejorar Ia salud de los peces. Para ello al alimento funcional se Ie puede agregar un complemento vitamínico y/o complemento nutricional. El alimento funcional, los complementos descritos o cualquiera de sus combinaciones pueden administrarse junto con un pienso, formar parte de Ia composición del pienso o pueden administrarse de forma independiente.
En una realización preferida, de Ia presente invención, los peces son cultivados.
En Ia presente invención se entiende por "peces cultivados" aquellos peces criados en piscifactorías, charcas o cualquier contenedor de agua de cualquier tamaño que permita Ia cría de peces y/o el engorde. Los peces cultivados pueden ser, sin limitar, peces destinados a Ia alimentación o a Ia cría de peces ornamentales.
En otra realización preferida, de Ia presente invención, los peces pertenecen al género Omochromis sp.
Los peces pertenecientes a este género se conocen como Tilapias. Las
Tilapias crecen en aguas cálidas dulces o saladas y tienen pocas exigencias respiratorias, rápido crecimiento y facilidad para Ia puesta. Los peces se seleccionan, sin limitar, de Ia lista que comprende O. amphimelas, O. andersonii,,O. angolensis, O. aureus, O. chungruruensis , O. esculentus, O. hunteri, O. ismailiaensis, O. jipe, O. karomo, O. karongae, O. korogwe, O. lepidurus, O. leucostictus, O. lidole, O. macrochir, O. malagarasi, O. mortimerí, O. mossambicus, O. mweruensis, O. niloticus (NiIe tilapia), O.
Pantani, O. pangani girígan, O. pangani pantani, O. placidus, O. placidus placidus, O. placidus ruvumae, O. rukwaensis, O. saka, O. salinicola, O. schwebischi, O. shiranus, O. shiranus chilwae, O. shiranus shiranus, O. spilurus, O. spilurus niger, O. spilurus percivali, O. spilurus spilurus, O. squamipinnis, O. tanganicae, O. upembae, O. urolepis, O. urolepis homorum, O. urolepis urolepis u O. varíabilis. Más preferiblemente los peces pertenecen a Ia especie O. niloticus (NiIe tilapia).
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG 1. Muestra el efecto protector de diferentes dosis de Selenio (selenito sódico) sobre las lesiones hepáticas inducidas por MC en tilapias expuestas a 120 μg MC/pez (dosis única).
(A, C, E, G) Tinción Hematoxilina-eosina. Barras 100 μm. (B, D, F, H) Observaciones ultraestructu rales (microscopia electrónica). Barras 10, 5, 10, 10 μm.
(A, B) Peces control; (C, D) tilapias expuestas sólo a MCs (120 μgMC/pez). C: Parénquima hepático desorganizado, hepatocitos con citoplasmas muy claros y el contorno celular a modo de célula en cebolla (flecha). D: El hepatocito presenta un núcleo denso normal (N) rodeado de un citoplasma con escasos organoides y el resto del citoplasma repleto de glucógeno granular (círculo); (E, F) Peces expuestos a MC+Selenio dosis baja (1 ,5 μg Se/g dieta). E. Parénquima con escasos hepatocitos con degeneración glucogénica sin mostrar Ia morfología de célula en cebolla (flecha). F. Hepatocitos con mayor desarrollo de los organoides citoplasmáticos (círculo). (G, H) Peces expuestos a MC+Selenio dosis media (3,0 μg Se/g dieta). G. Cordones hepáticos normales y H. Detalle de hepatocito normal con organoides citoplasmáticos, retículos (R), mitocondrias (estrella), lisosomas (flecha) y ausencia de glucógeno granular.
FIG. 2. Muestra el efecto protector de diferentes dosis de Selenio (selenito sódico) sobre las lesiones renales inducidas por MCs en tilapias expuestas a 120 μg MC/pez (dosis única).
(A, C, E, G) Tinción Hematoxilina-eosina. Barras 100 μm. (B, D, F, H) Observaciones ultraestructurales (microscopia electrónica). Barras 10, 10, 10, 5 μm. (A, B) peces control; (C, D) tilapias expuestas sólo a MCs (120 μgMC/pez.). C. Glomerulopatía y atrofia glomerular evidente (círculo), representado por una pérdida en el tamaño, hialinizaciones intraglomerulares y pérdida de capilares. D. Glomérulos con engrosamiento y densificaciones de las membranas básales (flechas) y colapsamientos de las luces de los capilares fenestrados (círculo). (E1 F) Peces expuestos a MC+Selenio dosis baja (1 ,5 μgSe/g dieta). E. Glomerulopatía con cierta desorganización interna (rombo), aumento de las células mesangiales (asterisco) y tenue dilatación de Ia cápsula de Bowman (flecha). F. Capilares fenestrados con Ia pared del endotelio (1), membrana basal (2) y podocitos (3) prácticamente normal y restos de endotelio tumefacto (círculo). (G1 H) Peces expuestos a MC+Selenio dosis media (3,0 μg Se/g dieta). G. Glomérulos prácticamente normales (círculos), algunos con cierta tumefacción de los capilares fenestrados (flecha). H. cierto grado de tumefacción del endotelio capilar (círculo).
FIG. 3. Muestra el efecto protector de diferentes dosis de Selenio (selenito sódico) sobre las lesiones en corazón inducidas por MCs en tilapias expuestas a 120 μg MC/pez (dosis única).
(A, C, E, G) Tinción Hematoxilina-eosina. Barras 100 μm. (B, D, F, H) Observaciones ultraestructurales (microscopía electrónica). Barras 5, 10, 10, 10 μm.
(A, B) peces control; (C, D) tilapias expuestas sólo a MCs (120 μg MC/pez). C. Miofibrolisis (flecha). Edema escaso (estrella) y microhemorragias (círculo). D. Pérdida casi total de las miofibrillas, restos de miofibrillas (flecha) y de mitocondrias (estrella). Abundante sarcoplasma sin estructura (círculo). (E, F) Peces expuestos a MC+Selenio dosis baja (1 ,5 μg Se/g dieta). E. Miofibrolisis parcial (círculo), escaso edema (estrella) y microhemorragias (flecha). F. Recuperación de miofibrillas con núcleo desplazado (N). (G, H) Peces expuestos a MC+Selenio dosis media (3,0 μg Se/g dieta). G. Tenue miofibrolisis (flecha). Zonas poco edematosas y escasas microhemorragias. H. Abundantes miofibrillas (flecha) y abundantes mitocondrias (círculo).
FIG. 4. Muestra el efecto protector de diferentes dosis de Selenio (selenito sódico) sobre las lesiones en tracto gastrointestinal inducidas por MCs en tilapias expuestas a 120 μg MC/pez (dosis única). (A, C, E, G) Tinción Hematoxilina-eosina. Barras 50, 50, 100, 100 μm. (B1 D, F, H) Observaciones ultraestructurales (microscopía electrónica). Barras 20, 10, 20, 20 μm (A, B) peces control; (C, D) tilapias expuestas sólo a MCs (120 μg MC/pez). C. Acortamiento de las vellosidades intestinales con necrosis en Ia zona apical (círculo). D. Detalle del epitelio intestinal con núcleos muy densos (N) y pérdida prácticamente total de las microvellosidades (círculo). (E, F) Peces expuestos a MC+Selenio dosis baja (1 ,5 μg Se/g dieta). E. Vellosidades cortas de escasos tamaños, vacuolizaciones citoplasmáticas en enterocitos (círculo). F. Detalle del epitelio con recuperación parcial de las microvellosidades (círculo). (G1 H) Peces expuestos a MC+Selenio dosis media (3,0 μg Se/g dieta). G. Vellosidades cortas, células intestinales (enterocitos) con vacuolización y células caliciformes (flecha). H. Recuperación parcial de las microvellosidades (círculo).
EJEMPLOS
A continuación se ilustrará Ia invención mediante unos ensayos realizados por los inventores que describen el uso de Selenio (selenito sódico) para tratamiento, prevención y/o recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a MCs.
EJEMPLO 1
La invención se llevó a cabo empleando un total de 64 peces macho de Orechromis niloticus (NiIe tilapia), de peso medio 50±7 g, y longitud de 12±2 cm, obtenidos en una piscifactoría, y transferidos en acuarios (96 L) con sistema de filtración de agua y aireación adecuados, y ciclos de 12/12 h luz/oscuridad. Los peces fueron alimentados con comida comercial (Dibaq, Segovia, España), en una cantidad de 0,3 g/día. Los peces se aclimataron durante 15 días antes del experimento. Se llevó a cabo Ia extracción de las MCs a partir de un liofilizado de células de cianobacterias procedentes de una floración natural que contenía 2885 μg/g de MC-LR, según el método de Moreno et al (2004, Biol Res 37:405- 417). Se utilizaron 8 grupos experimentales con 8 animales en cada uno. Cada grupo fue introducido en un acuario independiente: Acuario 1: peces control, alimentados sólo con pienso normal durante 7 días. Acuario 2: peces alimentados con pienso durante 7 días, intoxicados con MCs en Ia dieta (dosis única de 120 μg/pez). Acuarios 3, 5 y 7: Peces alimentados con pienso + Selenita sódico (equivalentes a 1.5, 3.0 ó 6.0 μg Selenio/g dieta, respectivamente) durante 7 días. Acuarios 4, 6 y 8: Peces con pienso + Se (1.5, 3.0 ó 6.0 μg Selenio/g dieta, respectivamente) durante 7 días. Los peces son infectados con una dosis única de 120 μg MC/pez.
Al final del experimento los peces fueron sacrificados, anestesiándolos con hielo, se procedió a Ia extracción de los órganos, que se fijaron en formol tamponado 10% 24 h a 4o C, y procesados para su estudio al microcopio óptico (etanol, xilol, parafina, y tinción hematoxilina y eosina) y al microscopio electrónico, de acuerdo con Atencio ef al (2008, Toxicol Pathol 36:449-458). Los resultados más significativos fueron los siguientes:
1) En Ia FIG 1 se observa Ia degeneración glucogénica del hígado producida por las MCs, mostrando los hepatocitos un contomo de células en cebolla. La dosis más baja de Selenio (1,5 μg Selenio/g dieta) no recuperó dicha degeneración, aunque fue menos severa, mientras que las dosis intermedias y elevadas recuperan Ia arquitectura del parénquima hepático, con hepatocitos poliédricos.
2) En Ia FIG 2 se observan los cambios degenerativos inducidos por MCs en riñon: atrofia glomerular, glomerulopatía, engrasamiento de las membranas básales y capilares fenestrados colapsados. Una recuperación total de dichas lesiones se consigue con Ia suplementación de 6.0 μg Selenio/g dieta.
3) Las lesiones cardiacas caracterizadas por una marcada miofibrolisis, edema generalizado y microhemorragias fueron totalmente superadas con Ia dosis de 6.0 μg Selenio/g dieta. 4) En tracto gastrointestinal, el proceso de enteritis necrótico producido por MCs fue recuperado, así como las lesiones en branquias.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso de una composición que comprende Selenio para Ia elaboración de un medicamento útil en el tratamiento y/o prevención de efectos tóxicos en peces expuestos a microcistinas.
2. Uso de una composición que comprende Setenio para Ia elaboración de un medicamento útil en Ia recuperación de efectos tóxicos en peces expuestos a microcistinas.
3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde los efectos tóxicos son alteraciones histopatológicas.
4. Uso según Ia reivindicación 3, donde las alteraciones histopatológicas son producidas en al menos uno de los tejidos de Ia lista que comprende hígado, riñon, corazón, branquias o tracto gastrointestinal.
5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el Setenio se administra en una cantidad diaria de entre 400 y 880 mg por Kg de peso del pez.
6. Uso según Ia reivindicación 5, donde Ia composición se presenta en una forma adaptada a Ia administración oral o intraperitoneal.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde Ia composición incluye excipientes farmacológicamente aceptables.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde Ia composición comprende además otra sustancia activa.
9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para Ia fabricación de un alimento funcional.
10. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para Ia fabricación de un complemento vitamínico.
11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para Ia fabricación de un complemento nutricional.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde los peces son cultivados.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde los peces pertenecen al género Orechromis sp.
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