WO1989007606A1 - Partly single-stranded and partly double-stranded nucleic acid probe and process for producing it - Google Patents

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WO1989007606A1
WO1989007606A1 PCT/EP1989/000122 EP8900122W WO8907606A1 WO 1989007606 A1 WO1989007606 A1 WO 1989007606A1 EP 8900122 W EP8900122 W EP 8900122W WO 8907606 A1 WO8907606 A1 WO 8907606A1
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WO
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nucleic acid
acid probe
probe according
metal ions
stranded
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Application number
PCT/EP1989/000122
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German (de)
French (fr)
Inventor
Günter VALET
Andreas Oser
Original Assignee
Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissensc
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids

Definitions

  • the invention relates in part to single-stranded and in part double-stranded nucleic acid probes which are complementary to a nucleic acid to be detected in their single-stranded region and contain a Guer cross-linking compound covalently bound to their double-stranded region, a process for their preparation and a method for the detection of nucleic acids by hybridization with such a nucleic acid probe to form a hybrid double strand.
  • radioactive labeled DNA probes include either direct labeling of the DNA samples by fluorochromes or enzymes or indirect labeling after attaching a group to which another labeled group is in turn bound after hybridization has taken place.
  • all of these methods have disadvantages.
  • radiolabelled DNA probes there is the problem of the instability of the radioactive compounds and the signals which become weaker over time, as well as the problem of safety when dealing with radioactive compounds.
  • fluorochro-labeled DNA probes are not sensitive enough.
  • Enzymes can be inactivated by stringent hybridization conditions and, due to an immune reaction, detectable groups attached to the hybridizing sequences. sequences are known, hinder the hybridization reaction. Indirect detection systems can also cause a high background due to unspecific bindings of the second partner of the immune reaction (antibodies or avidin / streptavidin in the case of biotin).
  • a partly single-stranded and partly double-stranded nucleic acid probe which, in its double-stranded region, contains a crosslinking compound covalently bound and is characterized in that a chelating agent for metal ions is bound to the nucleic acid probe via a functional group of the crosslinking compound is.
  • the nucleic acid probe in its single-stranded region is complementary to a nucleic acid to be detected.
  • This preferred nucleic acid probe according to the invention binds with its single-stranded region to the nucleic acid to be detected and, after the formation of a hybrid double strand of nucleic acid probe and nucleic acid to be detected, enables the detection of the hybrid double strand via the binding of fluorogenic metal ions to the chelating agent via the crosslinking agent Connection is bound to the nucleic acid probe.
  • the single-stranded region of the nucleic acid probe contains a homopolymer DNA tail, via which the probe preferred according to the invention has any nucleic acid sequence which is complementary to a nucleic acid to be detected and which has a homopolymer tail complementary to the homopolymer tail of the probe. can be coupled.
  • the cross-linking compound is preferably provided with an amino, thiol, hydroxyl or carboxy group as a functional group.
  • This functional group is expediently located on a side arm of the cross-linking connection.
  • Preferred as such a cross-linking compound is an intercalating compound which is embedded in the double-stranded area of the nucleic acid probe and is then covalently connected to the nucleic acid probe.
  • Preferred are psoralens, phenanthridium diazides, mitomycin C derivatives and carcinophilin A.
  • compounds of the general formula I are especially:
  • Y. "and Y-, H, alkyl or preferably represent methyl and Y. is a side arm which carries the functional group.
  • Y. is preferred here:
  • phenanthridium diazides are, above all, compounds of the general formula II
  • S represents a side arm which carries a functional group.
  • the structure is preferred, where S represents a side arm which carries a functional group.
  • R 1 , R ", m and n have the meanings defined for the general formula I of psoralens.
  • the synthesis of such a preferred phenanthridium azide is possible by known methods, for example by alkylation of the ring nitrogen atom. -? -
  • S represents a side arm that carries a functional group.
  • R ', R ", m and n correspond to those mentioned for the formula I and II.
  • a side arm S or Y with the meanings explained above is preferably coupled to the 19-C or 19a-C-carboxy group or to the 20-C or 20a-C-OH group of the molecule.
  • DTPA diethylenetriaminepentaacetate
  • EDTA ethylene - diamine tetraacetate
  • other polyaminocarboxylates are particularly suitable as chelating agents for metal ions.
  • These metal chelators must carry activated groups in order to be able to bind them to functional groups, for example a) intramolecular cyclic anhydrides of metal chelators, such as cyclic anhydride of DTPA (caDTPA), b) isothiocyanate groups as in 1- (p-isocyanatophenyl) EDTA , c) azo groups as in 1- (p-diazophenyl) EDTA, d) azido groups as in 4-azido-2-nitrophenyl-EDTA, e) N-hydroxysuccinimide groups or f) N-maleimido groups.
  • a) intramolecular cyclic anhydrides of metal chelators such as cyclic anhydride of DTPA (caDT
  • Preferred chelating agents are caDTPA, the mixed anhydride of DTPA and isobutylcarboxycarboxylic acid, 1- (p-isothiocyanatophenyl) -DTPA, 1- (p-isothiocyanatophenyl) -EDTA, 1- (p-diazophenyl) -EDTA or a phenylazide - derivative used by DTPA or EDTA.
  • chelating agents for metal ions are not only understood to mean a compound as mentioned above, but also a cryptate, that is to say a macropolycyclic ligand for metal ions.
  • the cryptate consists of O, o (-bipyridine or 1,10-phenantroline units.
  • a cryptate can already contain fluorescent metal ions.
  • Fluoroscent metal ions which are preferably used are ions of the rare earth metals.
  • the ions Eu 3+, Tb3-1- or / and Sm3 + are particularly preferred.
  • the nucleic acid probe additionally contains a linker molecule between the cross-linking compound and the chelating agent.
  • This linker molecule is bound to the functional group of the cross-linking compound and to the chelating agent.
  • the linker molecule is therefore preferably a bifunctional crosslinking reagent.
  • the linker molecule is particularly preferably a heterobifunctional crosslinking reagent, such as, for example, 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester, the N-maleimido group being thiol group-specific and the N-hydroxysuccinimide ester being amino groups -is specific.
  • the nucleic acid probe contains between the cross-linking compound or optionally the linker molecule and the chelating agent additionally a macromolecular carrier molecule with at least one functional amino or thiol group.
  • This carrier molecule can contain any number of functional groups which are used for binding chelate ligands and for coupling to the nucleic acid sample via the crosslinking compound or the linker molecule.
  • Suitable carrier molecules are homopolymeric or heteropolymeric polypeptides and other chemical and biological macromolecules with functional groups.
  • the carrier molecule is preferably a homopolymeric or heteropolymeric polypeptide.
  • the carrier molecule is particularly preferably polylysine or polycysteine.
  • Another object of the invention is a method for producing a nucleic acid according to the invention which is complementary to a nucleic acid to be detected, which is characterized in that a DNA sequence complementary to a nucleic acid sequence to be detected is inserted into a double-stranded plasmid, with a restriction endonuclease in the region of Cuts inserts and thereby linearizes the plasmid, selectively degrades only one strand of the linearized double strand in the region of the insert with an exonuclease, covalently couples to the remaining double strand a cross-linking compound which contains at least one functional group, and binds a chelating agent to the functional groups.
  • plasmids which contain only a few restriction sites and thus permit cleavage in the insert without the plasmid sequence also being cut thereby would, for example the plasmid pBR322.
  • a DNA strand from the 5 'end for example with exonuclease III on the opposite sides of the linearized plasmid, or the strand from the 3' end with L-exonuclease, is degraded.
  • the cross-linking compound which is preferably a compound intercalating between a DNA double strand
  • the DNA is then effected.
  • a psoralen or a phenantridium diazide is preferably used for this and the covalent binding to the nucleic acid probe is effected by irradiation with UV light.
  • mitomycin C or carcinophilin A is used for this and the covalent binding to the nucleic acid probe is effected by acidifying the reaction solution.
  • the cross-linking compound preferably contains an amino, thiol, hydroxy or as a functional group - 3 -
  • the chelating agent which contains a group activated for reaction with a functional group, is then attached to this functional group.
  • This chelating agent is preferably caDPTA, the mixed anhydride of DTPA and isobutylcarboxylic acid, 1- (p-isolothio ⁇ yanatophenyl) DTPA, 1- (p-isothio- ⁇ yanatophenyl) EDTA, 1- (p-diazophenyl) EDTA or a phenyl azide - derivative of DTPA or EDTA.
  • a chelating agent in the sense of the invention is also understood to mean a cryptate.
  • a cryptate composed of 0 ⁇ , ⁇ / - bipyridine or 1,10-phenantroline units is preferably used here. It is also preferred here to use cryptates which already contain fluorogenic metal ions, the fluorogenic metal ions in turn preferably being ions of the rare earth metals. Cryptates are particularly preferred
  • a linker molecule is additionally introduced between the crosslinking compound and the chelating agent.
  • This linker molecule is reacted with the functional or activated groups of the cross-linking compound and the chelating agent.
  • a linker molecule which is a bifunctional crosslinking reagent.
  • a heterobifunctional crosslinking reagent that is to say a crosslinking reagent which contains two different functional groups, for example 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester, is particularly preferably used as the linker molecule.
  • the linker molecule and the chelating agent additionally include a macromolecular carrier molecule with at least one functional amino or thiol group.
  • a macromolecular carrier molecule with at least one functional amino or thiol group.
  • chelating molecules are increasingly made available for fluorogenic metal ions, as a result of which the detection signal to be obtained later is amplified.
  • a homopolymeric or heteropolymeric polypeptide particularly preferably polylysine or polystyrene, is used as the carrier molecule.
  • Another object of the invention is another method for producing a nucleic acid probe which contains a sequence complementary to a nucleic acid to be detected, in which a nucleic acid probe according to claim 3 with a single-stranded DNA or RNA, the sequence required for detection hybridization and a homopolymer Single strand, which is complementary to the nucleic acid probe according to claim 3, contains hybridized.
  • the invention further relates to a method for the detection of nucleic acids by hybridization with a nucleic acid probe to form a hybrid double strand, which is characterized in that a nucleic acid probe according to the invention which contains the sequence complementary to a nucleic acid to be detected is used after hybridization, a solution of a fluorogenic metal ion is added and, after removing the metal ion solution and washing, the hybrid double strand formed is exposed to the fluorescence of the I - ⁇ ⁇ -
  • Another object of the invention is a method for the detection of nucleic acids by hybridization with a nucleic acid probe to form a hybrid double strand, in which one uses a nucleic acid probe according to claim 3 to 15, this either with a single-stranded DNA or RNA which the a nucleic acid complementary sequence to be detected and a homopolymeric nucleic acid tail, which is complementary to the homopolymeric single strand of the nucleic acid probe according to claim 3, and simultaneously or thereafter hybridizes with the nucleic acid probe to be detected, adds a solution of a fluorogenic metal ion after hybridization and after removing the metal ion solution and Washing the bound metal ions is extracted by an amplifier solution and the hybrid double strand formed is detected via the fluorescence of the metal ions in the amplifier solution.
  • Rare earth ions are preferably used as the fluorogenic metal ions. Are particularly preferred
  • the hybridization is carried out with a nucleic acid to be detected, which is bound on a support, for example on a filter, gel, microtiter plate, histological section, cell, the fluorogenic metal ions are added after hybridization has taken place and after washing to remove excess uncomplexed metal ions, the metal ions are detached from the complex by an intensifying solution and their fluorescence in the amplified solution is determined.
  • a non-ionic detergent 0.1 - 0.05%, v / v, e.g.
  • Triton Triton
  • a "synergistic base” (10 - 100 ⁇ M, e.g. 50 ⁇ M tri-n-octylphosphine oxide) and an energy Dissolve donor (10 ⁇ M - 100 ⁇ M of a ⁇ -diketone, eg 15 ⁇ M 2-naphthoyltrifluoroacetone) in an aqueous buffer solution with a pH between 2.5 and 4.
  • a preferred strengthening solution contains 0.1 M acetate phthalate buffer, pH 3.2, 0.1% Triton X-100 (v / v), 15 ⁇ M 2-naphthoyltrifluoroacetone and 50 ⁇ M tri-n-octylphosphine oxide.
  • nucleic acid probe labeled with the chelate ligands cannot already be used in a metal-bound manner since the metal ions would dissociate from the chelate under these conditions . Consequently, the metal ions are only added after the hybridization reaction has taken place. An exception to this are, however, mild hybridization conditions in which a nucleic acid probe pre-labeled with metal ions can also be used.
  • the determination of the fluorescence of the metal ions after removal from the labeled hybrid double strand in solution is above all an advantage if, for example, the method according to the invention is used in the context of clinical and medical applications, since the nucleic acids to be detected can often not be used in this way clean form used, but there are still contaminants from accompanying biological material, such as cells, tissues, etc., present. This can result in a disturbance in the measurement, but this can be caused by removing the fluorescent -. 3 -
  • Another advantage that results from the removal of the metal ions from the marked hybrid double strand is that, with small amounts of metal ions bound to the hybrid strand, the solution of the ions can still be concentrated and a more precise measurement can thereby be achieved.
  • the metal ions are expediently added even in the form of a complex.
  • the complex formation constant of this complex should also be relatively high (log K at least 5), but significantly lower than that of the metal ion compared to the chelating agent bound to the probe. This prevents non-specific binding of the metal ions to other binding sites, such as phosphate groups of the nucleic acids or binding sites on the filter, etc.
  • Another object of the invention is a method for the detection of nucleic acids by hybridization with a nucleic acid probe to form a hybrid double strand, which is characterized in that a nucleic acid probe according to the invention is used which contains a cryptate as chelating agent which already contains a fluorogenic metal ion.
  • a nucleic acid probe according to the invention which contains a cryptate as chelating agent which already contains a fluorogenic metal ion.
  • the fluorescence of the metal ions can also be determined directly on the hybrid double strand after hybridization has taken place. It will ⁇ ) H
  • a nucleic acid probe and a method for the detection of nucleic acids are thus provided which make it possible to detect nucleic acids with high specificity without using radioactive compounds or enzymatically or immunologically labeled probes.
  • the use of a carrier molecule to which several chelating agents can be bound which results in an amplification of the signal from fluorogenic metal ions, results in a high sensitivity of the method according to the invention.
  • Figure 1 shows schematically the synthesis of psoralen SH
  • Fig. 2 shows the elution profile of a
  • Psoralen-SH was produced according to the method of Saffran et al, Proc.Natl.Acad.Sci.üSA 79, 4594-4598 (1982). The individual reaction steps of the synthesis are shown in Figure 1. All reactions were carried out in the dark. la) Preparation of 4'-chloromethyl-4,5 ', 8-trimethyl-psoralen (2):
  • PSH (5) was freshly made for each labeling reaction. 24 ⁇ l of a 1.7 mM stock solution of compound 4 in ethanol, 40 ⁇ l 100 mM dithioerythitol (DTE) and 16 ⁇ l H 2 O were mixed in an Eppendorf vessel and incubated for one hour at room temperature in the dark . - / -
  • the reaction was stopped by adding 2.5 ul 100 mM EDTA.
  • the DNA was precipitated with ethanol, washed with 70% ethanol and resuspended in 36 ⁇ l H_0.
  • exonuclease III 90 U
  • 10xExo-III buffer 660 mM Tris-HCl, 6.6 mM MgCl 2 , 10 mM mercaptoethanol, pH 7.6 was added and the solution at 37 ° C. for 30 minutes long incubated to make the plasmid partially single-stranded.
  • the reaction was stopped by adding 5 ul 100 mM EDTA.
  • pKKHBs34 The partially single-stranded pKKHBs34 (hereinafter referred to as pKKHBs34 ') was separated from the enzyme, nucleotides and buffer via a NENSORB-20 nucleic acid cleaning cartridge in accordance with the manufacturer's instructions.
  • Psoralen molecules intercalate into double-stranded DNA and undergo photocycloaddition with DNA thymidine residues when irradiated with long-wave UV light (Cimino et al, Ann.Rev.Bochem. 5_4, 1151-1193 (1985)).
  • Double strands are easily formed in TA / AT sequences, single strand DNA remains unmodified.
  • the amount of PSH covalently bound to the DNA was determined by reacting the SH groups with the thiol-specific fluorescent dye, 7-di-ethylamino-3- (4'-maleimidophenyl) -4-methylcoumarin ( CPM).
  • CPM 7-di-ethylamino-3- (4'-maleimidophenyl) -4-methylcoumarin
  • the fluorescence of CPM is significantly increased when it is covalently bound to thiol groups.
  • SH-labeled pKKHBs34 * (7.5 ⁇ g) was in 50 ⁇ l 50 mM phosphate buffer (pH 7.8) containing 200 ⁇ M CPM and 1 mM EDTA, dissolved.
  • the DTPA content in PLL was determined by equilibrium dialysis.
  • DTPA-PLL conjugate (20 ⁇ g) was incubated for two hours with 500 ⁇ M EuCl 3 , 500 ⁇ M EDTA in 200 ⁇ l 50 mM sodium citrate buffer (pH 6.0) and then equilibrated against 5 mM sodium acetate, 10 mM NaCl ( pH 5.5) dialyzed.
  • the europium and thus the DTPA content was determined by time-delayed fluorometry Right.
  • DTP -bound PLL (100 ⁇ g, 6 nmol) in 100 ⁇ l 100 mM KHCO-. (pH 8.2) was cooled on ice.
  • the heterobifunctional cross-linking agent, 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid N-hydroxy-succinimide ester (10 ⁇ g, 30 nmol, from a 1 mg / ml solution in dry dimethylformamide) became slow added with shaking.
  • the solution was shaken for a further 30 minutes at room temperature and, after adjusting the pH to 6.5 with 0.6 N HCl, SH-labeled pKKHBs34 '(7.5 ⁇ g) was incubated overnight at room temperature.
  • the resulting conjugate was isolated by DEAE chromatography (Fig. 2).
  • pKKHBs34 as target DNA in various amounts and pBR322 and calf thymus DNA as controls were immobilized on nitrocellulose filter disks (BA 85 NC filter, 4-5 mm diameter, Schleicher and Schuell) and denatured using standard methods (Anderson and Young, in Harnes BD and Higgins (ed.), Nucleic Acid. Hybridization ; A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Washington, DC, 73-111 (1985)).
  • Chelation of the hybrid-bound DTPA with European ions was achieved by incubating the filters from Example 6 in 100 ⁇ M EuCl 3 , 100 ⁇ M EDTA, 1 ⁇ SSC (pH 7.0, 200 ⁇ l per microtiter plate) for two hours at room temperature.
  • the filters were washed at least six times in 2x SSC and finally for 15 minutes in 1 ml "booster solution" (0.1 M acetate phthalate buffer, pH 3.2, 0.1% Triton X-100 (v / v) , 15 ⁇ M 2-naphthoyltrifluoroacetone, 50 ⁇ M trin-octylpho'sphin ⁇ oxide) were shaken in polystyrene vessels to remove DTPA-bound Eu 3+. The supernatant was decanted and the fluorescence was determined in an "Arcus 1230" time-delayed fluorometer (LKB-Wallac, Turku, Finland). Excitation and emission were 340 and 613 nm, respectively. Delay and count times were both set to 400 ⁇ s (Fig. 3).

Abstract

A partly single-stranded and partly double-stranded nucleic acid probe containing a transverse-crosslinking compound covalently bonded to its double-strand region has a chelating agent for metallic ions bonded to the nucleic acid probe by a functional group of the transverse-crosslinking compound. This nucleic acid probe is useful for detecting nucleic acids by hybridization with formation of a hybrid double strand. Following successful hybridization, a solution of fluorogenic metallic ions is added, and after removal of the metallic ion solution and washing, the bonded metallic ions are extracted by means of a reinforcing solution. The hybrid double strand so formed is detected by the fluorescence of the metallic ions in the reinforcing solution.

Description

Teils einzel- und teils doppelsträngige Nukleinsäuresonde und Verfahren zu ihrer Herstellung Partly single and partly double-stranded nucleic acid probe and method for their production
Die Erfindung betrifft teils einzel- und teils doppel¬ strängige Nukleinsäuresonden, die in ihrem einzel- strängigen Bereich zu einer nachzuweisenden Nuklein- säure komplementär sind und an ihren doppelsträngigen Bereich kovalent gebunden eine guervernetzende Verbin¬ dung enthalten, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer solchen Nukleinsäure¬ sonde unter Ausbildung eines Hybriddoppelstrangs.The invention relates in part to single-stranded and in part double-stranded nucleic acid probes which are complementary to a nucleic acid to be detected in their single-stranded region and contain a Guer cross-linking compound covalently bound to their double-stranded region, a process for their preparation and a method for the detection of nucleic acids by hybridization with such a nucleic acid probe to form a hybrid double strand.
Die Hybridisierung von Nukleinsäuren ist eine weitver¬ breitete Technik sowohl in der Forschung als auch für klinische Anwendung zum Nachweis von spezifischen Nu- kleotidsequenzen in DNA oder RNA. Bisher werden hierfür meist radioaktiv markierte DNA-Sonden verwendet. Nicht¬ radioaktive Detektionssysteme schließen entweder direk¬ te Markierung der DNA-Proben durch Fluorochrome oder Enzyme oder indirekte Markierung nach Anbringen einer Gruppe ein, an die wiederum eine andere markierte Gruppe nach erfolgter Hybridisierung gebunden wird. Alle diese Methoden haben jedoch Nachteile. So stellt sich bei Verwendung von radioaktiv markierten DNA- Sonden das Problem der Instabilität der radioaktiven Verbindungen und der damit im Laufe der Zeit schwächer werdenden Signale sowie das Problem der Sicherheit im Umgang mit radioaktiven Verbindungen. Fluorochro mar- kierte DNA-Sonden sind dagegen nicht sensitiv genug. Enzyme können durch stringente Hybridisierungsbedingun- gen inaktiviert werden, und aufgrund einer Immunreaktion nachweisbare Gruppen, die an die hybridisierenden Se- quenzen angebracht werden, kennen die Hybridisierungs- reaktion behindern. Indirekte Detektionssysteme können außerdem einen hohen Hintergrund aufgrund von unspezi¬ fischen Bindungen des zweiten Partners der Immunreak¬ tion (Antikörper bzw. Avidin/Streptavidin im Falle von Biotin) verursachen.The hybridization of nucleic acids is a widely used technique both in research and for clinical use for the detection of specific nucleotide sequences in DNA or RNA. So far, mostly radioactive labeled DNA probes have been used for this. Non-radioactive detection systems include either direct labeling of the DNA samples by fluorochromes or enzymes or indirect labeling after attaching a group to which another labeled group is in turn bound after hybridization has taken place. However, all of these methods have disadvantages. When using radiolabelled DNA probes, there is the problem of the instability of the radioactive compounds and the signals which become weaker over time, as well as the problem of safety when dealing with radioactive compounds. In contrast, fluorochro-labeled DNA probes are not sensitive enough. Enzymes can be inactivated by stringent hybridization conditions and, due to an immune reaction, detectable groups attached to the hybridizing sequences. sequences are known, hinder the hybridization reaction. Indirect detection systems can also cause a high background due to unspecific bindings of the second partner of the immune reaction (antibodies or avidin / streptavidin in the case of biotin).
Es war daher die Aufgabe der Erfindung, ein nicht ra¬ dioaktives Markierungssystem für Nukleinsäuresonden bereitzustellen, das es ermöglicht, mit geringem Hin¬ tergrund und ohne eine Gefahr der Inaktivierung der Markierung sowie ohne die Probleme der Radioaktivität Nukleinsäuren mit hoher Sensitivität nachzuweisen.It was therefore the object of the invention to provide a non-radioactive labeling system for nucleic acid probes, which makes it possible to detect nucleic acids with high sensitivity with little background and without the risk of inactivation of the label and without the problems of radioactivity.
Gelöst wird diese Aufgabe durch eine teils einzel- und teils doppelsträngige Nukleinsäuresonde, die ann ihrem doppelsträngigen Bereich kovalent gebunden eine quer¬ vernetzende Verbindung enthält und dadurch gekenn¬ zeichnet ist, daß über eine funktionelle Gruppe der quervernetzenden Verbindung ein Chelatbildner für Metallionen an die Nukleinsäuresonde gebunden ist.This object is achieved by a partly single-stranded and partly double-stranded nucleic acid probe which, in its double-stranded region, contains a crosslinking compound covalently bound and is characterized in that a chelating agent for metal ions is bound to the nucleic acid probe via a functional group of the crosslinking compound is.
In. einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäuresonde in ihrem einzelsträngigen Bereich zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär. Diese bevorzugte erfindungsgemäße Nukleinsäuresonde bindet mit ihrem einzelsträngigen Bereich an die nach¬ zuweisende Nukleinsäure und ermöglicht nach Bildung eines Hybriddoppelstrangs aus Nukleinsäuresonde und nachzuweisender Nukleinsäure den Nachweis des Hybrid- doppelstrangs über die Bindung von fluorogenen Metall¬ ionen an den Chelatbildner, der über die querver¬ netzende Verbindung an die Nukleinsäuresonde gebunden ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfin¬ dung enthält der einzelsträngige Bereich der Nuklein¬ säuresonde einenHomopolymer-DNS-Schwanz, über den an diese erfindungsgemäß bevorzugte Sonde jegliche zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementäre Nukleinsäuresequenz, welche einen zum Homopolymer¬ schwanz der Sonde komplementären Homopolymerschwanz aufweist, angekoppelt werden kann. Hierdurch eröffnet sich die Möglichkeit, an Nukleinsäuresequenzen zum Nachweis dazu komplementärer Sequenzen in einfacher Weise eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresonde anzu¬ koppeln und nach erfolgter Hybridisierung den Hybrid¬ doppelstrang wiederum über die Bindung von fluorogenen Metallionen an den Chelatbildner nachzuweisen.In. In a preferred embodiment of the invention, the nucleic acid probe in its single-stranded region is complementary to a nucleic acid to be detected. This preferred nucleic acid probe according to the invention binds with its single-stranded region to the nucleic acid to be detected and, after the formation of a hybrid double strand of nucleic acid probe and nucleic acid to be detected, enables the detection of the hybrid double strand via the binding of fluorogenic metal ions to the chelating agent via the crosslinking agent Connection is bound to the nucleic acid probe. In another preferred embodiment of the invention, the single-stranded region of the nucleic acid probe contains a homopolymer DNA tail, via which the probe preferred according to the invention has any nucleic acid sequence which is complementary to a nucleic acid to be detected and which has a homopolymer tail complementary to the homopolymer tail of the probe. can be coupled. This opens up the possibility of coupling a nucleic acid probe according to the invention to nucleic acid sequences for the detection of complementary sequences in a simple manner and, after hybridization has taken place, again detecting the hybrid double strand by binding fluorogenic metal ions to the chelating agent.
Die quervernetzende Verbindung ist bevorzugt mit einer Amino-, Thiol-, Hydroxy- oder Carboxygruppe als funktio- neller Gruppe versehen. Diese funktionelle Gruppe befindet sich zweckmäßigerweise an einem Seitenarm der quervernetzenden Verbindung.The cross-linking compound is preferably provided with an amino, thiol, hydroxyl or carboxy group as a functional group. This functional group is expediently located on a side arm of the cross-linking connection.
Bevorzugt ist als eine solche quervernetzende Verbin¬ dung eine interkalierende Verbindung, die sich im doppelsträngigen Bereich der Nukleinsäuresonde ein¬ lagert und dann kovalent mit der Nukleinsäuresonde verbunden wird. Bevorzugt sind hierbei Psoralene, Phenanthridiumdiazide, Mitomycin C-Derivate und Carcinophilin A. Bei den Psoralenen, die selektiv .und kovalent mit doppelsträngiger DNA reagieren, sind vor allem Verbindungen der allgemeinen Formel I:Preferred as such a cross-linking compound is an intercalating compound which is embedded in the double-stranded area of the nucleic acid probe and is then covalently connected to the nucleic acid probe. Preferred are psoralens, phenanthridium diazides, mitomycin C derivatives and carcinophilin A. In the psoralens, which react selectively and covalently with double-stranded DNA, compounds of the general formula I are especially:
(I)(I)
Figure imgf000005_0001
geeignet, wobei Y. , „ und Y-, H, Alkyl- oder bevorzugt Methyl- darstellen und Y. ein Seitenarm ist, der die funktioneile Gruppe trägt. Die Struktur von Y. ist hierbei bevorzugt:
Figure imgf000005_0001
suitable, where Y., "and Y-, H, alkyl or preferably represent methyl and Y. is a side arm which carries the functional group. The structure of Y. is preferred here:
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0001
wobei R' = H, Alkyl-, CHO oder bevorzugt H, m,n = eine Zahl zwischen 1 und 10, bevorzugt 3 und R' ' = ein Anteil von Y, , der die funktionelle Gruppe enthält, z.b. -NH-, -SH, -OH, -COOH, -NH-Sp-SH, wobei Sp ein "Spacer" ist, z.B. -C0-(CH ) -, und y eine Zahl zwischen 0 und 10 ist.where R '= H, alkyl, CHO or preferably H, m, n = a number between 1 and 10, preferably 3 and R' '= a proportion of Y, which contains the functional group, e.g. -NH-, -SH, -OH, -COOH, -NH-Sp-SH, where Sp is a "spacer", e.g. -C0- (CH) -, and y is a number between 0 and 10.
Bei den Phenanthridiumdiaziden sind vor allem Verbindun¬ gen der allgemeinen Formel IIThe phenanthridium diazides are, above all, compounds of the general formula II
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geeignet, wobei S einen Seitenarm darstellt, der eine funktioneile Gruppe trägt. Bevorzugt ist die Struktur
Figure imgf000006_0002
suitable, where S represents a side arm which carries a functional group. The structure is preferred
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wobei R1 , R", m und n die für die allgemeine Formel I der Psoralene definierten Bedeutungen aufweisen. Die Synthese eines solchen bevorzugten Phenanthridiumazids ist nach bekannten Methoden, z.B. durch Alkylierung des Ring-Stickstoffatoms möglich. - ? -
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where R 1 , R ", m and n have the meanings defined for the general formula I of psoralens. The synthesis of such a preferred phenanthridium azide is possible by known methods, for example by alkylation of the ring nitrogen atom. -? -
Bei den Mitomycin C-Derivaten sind vor allem Verbindun¬ gen der allgemeinen Formel IIIIn the case of the mitomycin C derivatives, compounds of the general formula III are particularly important
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geeignet, wobei wiederum S einen Seitenarm darstellt, der eine funktioneile Gruppe trägt. Die Bedeutungen von S, R' , R" , m und n entsprechen den für die Formel I bzw. II genannten.
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suitable, again S represents a side arm that carries a functional group. The meanings of S, R ', R ", m and n correspond to those mentioned for the formula I and II.
Bei Carcinophilin A ist bevorzugt ein Seitenarm S oder Y. mit den oben erläuterten Bedeutungen an die 19-C- bzw. 19a-C-Carboxygruppe oder an die 20-C- bzw. 20a-C- OH-Gruppe des Moleküls gekoppelt.In the case of carcinophilin A, a side arm S or Y with the meanings explained above is preferably coupled to the 19-C or 19a-C-carboxy group or to the 20-C or 20a-C-OH group of the molecule.
Als Chelatbildner für Metallionen sind Verbindungen, wie DTPA (Diethylentriaminpentaacetat) , EDTA (Ethylen- - diamintetraacetat) und andere Polyaminocarboxylate, besonders gut geeignet. Diese Metallchelatoren müssen aktivierte Gruppen tragen, um sie an funktionelle Gruppen binden zu können, beispielsweise a) intramolekulare cyclische Anhydride von Metallchela¬ toren, wie cyclisches Anhydrid von DTPA (caDTPA) , b) Isothiocyanatgruppen wie in 1-(p-Isocyanatophenyl) - EDTA, c) Azogruppen wie in 1- (p-Diazophenyl) -EDTA, d) Azidogruppen wie in 4-Azido-2-nitrophenyl-EDTA, e) N-Hydroxysuccinimidgruppen oder f) N-Maleimidogruppen.Compounds such as DTPA (diethylenetriaminepentaacetate), EDTA (ethylene - diamine tetraacetate) and other polyaminocarboxylates are particularly suitable as chelating agents for metal ions. These metal chelators must carry activated groups in order to be able to bind them to functional groups, for example a) intramolecular cyclic anhydrides of metal chelators, such as cyclic anhydride of DTPA (caDTPA), b) isothiocyanate groups as in 1- (p-isocyanatophenyl) EDTA , c) azo groups as in 1- (p-diazophenyl) EDTA, d) azido groups as in 4-azido-2-nitrophenyl-EDTA, e) N-hydroxysuccinimide groups or f) N-maleimido groups.
Die Komplexbildungskonstante zwischen dem Chelatligan- den und einem Metallion muß hierbei groß sein (log K ^10) . Bevorzugt werden als Chelatbildner caDTPA, das gemischte Anhydrid von DTPA und Isobutylcarboxycarbon- säure, 1-(p-Isothiocyanatophenyl)-DTPA, 1-(p-Isothio- cyanatophenyl)-EDTA, 1-(p-Diazophenyl)-EDTA oder ein Phenylazid-Derivat von DTPA oder EDTA verwendet. Wei¬ ter wird im Rahmen der Erfindung unter Chelatbildner für Metallionen nicht nur eine Verbindung, wie oben ge¬ nannt, verstanden, sondern auch ein Kryptat, also ein makropolycyclischer Ligand für Metallionen. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Kryptat aus O ,o( -Bipyridin oder 1,10-Phenantrolin-Einheiten.The complex formation constant between the chelate ligand and a metal ion must be large (log K ^ 10). Preferred chelating agents are caDTPA, the mixed anhydride of DTPA and isobutylcarboxycarboxylic acid, 1- (p-isothiocyanatophenyl) -DTPA, 1- (p-isothiocyanatophenyl) -EDTA, 1- (p-diazophenyl) -EDTA or a phenylazide - derivative used by DTPA or EDTA. Within the scope of the invention, chelating agents for metal ions are not only understood to mean a compound as mentioned above, but also a cryptate, that is to say a macropolycyclic ligand for metal ions. In a preferred embodiment, the cryptate consists of O, o (-bipyridine or 1,10-phenantroline units.
Ein Kryptat kann im Sinne der Erfindung bereits fluoreszente Metallionen enthalten. Bevorzugt verwendete fluoroszente Metallionen sind Ionen der seltenen Erdmetalle. Besonders bevorzugt sind hierbei die Ionen Eu 3+ , Tb3-1- oder/und Sm3+According to the invention, a cryptate can already contain fluorescent metal ions. Fluoroscent metal ions which are preferably used are ions of the rare earth metals. The ions Eu 3+, Tb3-1- or / and Sm3 + are particularly preferred
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Er¬ findung enthält die Nukleinsäuresonde zusätzlich zwi¬ schen der quervernetzenden Verbindung und dem Chelat¬ bildner ein Linkermolekül. Dieses Linkermolekül ist an die funktionelle Gruppe der quervernetzenden Verbindung und an den Chelatbildner gebunden. Bevorzugt ist daher das Linkermolekül ein bifunktionelles Vernetzungsrea¬ gens. Besonders bevorzugt ist das Linkermolekül ein heterobifunktionelles Vernetzungsreagens, wie bei¬ spielsweise 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carbon- säure-N-hydroxysuccinimidester, wobei die N-Maleimido- gruppe thiolgruppen-spezifisch und der N-Hydroxysuccini- midester aminogruppen-spezifisch ist.In a further preferred embodiment of the invention, the nucleic acid probe additionally contains a linker molecule between the cross-linking compound and the chelating agent. This linker molecule is bound to the functional group of the cross-linking compound and to the chelating agent. The linker molecule is therefore preferably a bifunctional crosslinking reagent. The linker molecule is particularly preferably a heterobifunctional crosslinking reagent, such as, for example, 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester, the N-maleimido group being thiol group-specific and the N-hydroxysuccinimide ester being amino groups -is specific.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Er¬ findung enthält die Nukleinsäuresonde zwischen der quervernetzenden Verbindung bzw. gegebenenfalls dem Linkermolekül und dem Chelatbildner zusätzlich ein makromolekulares Trägermolekül mit mindestens einer funktionellen Amino- oder Thiolgruppe. Dieses Träger¬ molekül kann eine beliebig große Anzahl funktioneller Gruppen enthalten, die zur Bindung von Chelatliganden und zur Kupplung an die Nukleinsäureprobe über die quervernetzende Verbindung bzw. das Linkermolekül die¬ nen. Als Trägermoleküle geeignet sind homopolymere oder heteropolymere Polypeptide sowie andere chemische und biologische Makromoleküle mit funktioneilen Gruppen. Bevorzugt ist das Trägermolekül ein homopolymeres oder heteropolymeres Polypeptid. Besonders bevorzugt ist das Trägermolekül Polylysin oder Polycystein.In a further preferred embodiment of the invention, the nucleic acid probe contains between the cross-linking compound or optionally the linker molecule and the chelating agent additionally a macromolecular carrier molecule with at least one functional amino or thiol group. This carrier molecule can contain any number of functional groups which are used for binding chelate ligands and for coupling to the nucleic acid sample via the crosslinking compound or the linker molecule. Suitable carrier molecules are homopolymeric or heteropolymeric polypeptides and other chemical and biological macromolecules with functional groups. The carrier molecule is preferably a homopolymeric or heteropolymeric polypeptide. The carrier molecule is particularly preferably polylysine or polycysteine.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, welche zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementär ist, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine zu einer nachzuweisenden Nukleinsäuresequenz komplementäre DNA-Sequenz in ein doppelsträngiges Plasmid insertiert, mit einer Restriktionsendonuklease im Bereich des Inserts schneidet und dadurch das Plasmid linearisiert, mit einer Exonuklease von beiden Seiten her jeweils selektiv nur einen Strang des linearisierten Doppel¬ strangs im Bereich des Inserts abbaut, an den verblei¬ benden Doppelstrang eine quervernetzende Verbindung kovalent koppelt, die mindestens eine funktionelle Gruppe enthält, und an die funktioneilen Gruppen einen Chelatbildner bindet.Another object of the invention is a method for producing a nucleic acid according to the invention which is complementary to a nucleic acid to be detected, which is characterized in that a DNA sequence complementary to a nucleic acid sequence to be detected is inserted into a double-stranded plasmid, with a restriction endonuclease in the region of Cuts inserts and thereby linearizes the plasmid, selectively degrades only one strand of the linearized double strand in the region of the insert with an exonuclease, covalently couples to the remaining double strand a cross-linking compound which contains at least one functional group, and binds a chelating agent to the functional groups.
Als doppelsträngige Plasmide sind vor allem Plasmide geeignet, die nur wenige Restriktionsschnittstellen enthalten und somit eine Spaltung im Insert erlauben, ohne daß dadurch auch die Plasmidsequenz geschnitten würde, beispielsweise das Plasmid pBR322. Nach der Linearisierung des Plasmids wird kontrolliert beispiels¬ weise mit Exonuklease III an den gegenüberliegenden Seiten des linearisierten Plasmids jeweils ein DNA- Strang vom 5'-Ende her oder mit L-Exonuklease jeweils der Strang vom 3'-Ende her abgebaut. Hierdurch entsteht, im Bereich des Inserts ein einzelsträngiger Bereich, der zur Hybridisierung mit nachzuweisenden Nuklein¬ säuren geeignet ist, und es verbleibt ein doppelsträn- giger Bereich, an den eine quervernetzende Verbindung kovalent gebunden werden kann. Abweichend hiervon ist es jedoch auch möglich, Nukleinsäuren in einen einzel¬ strängigen Phagen (beispielsweise Ml3) zu klonieren und dann doppelsträngige Vektorbereiche nach der Methode von Hu und Messing, Gene 17/ 271-277 (1982), 'oder Courage-Tebbe und Ke per, Biochim.Biophys. A. 697, 1-5 (1982) , herzustellen, wobei die Inserts jedoch einzel- strängig bleiben.Particularly suitable as double-stranded plasmids are plasmids which contain only a few restriction sites and thus permit cleavage in the insert without the plasmid sequence also being cut thereby would, for example the plasmid pBR322. After linearization of the plasmid, a DNA strand from the 5 'end, for example with exonuclease III on the opposite sides of the linearized plasmid, or the strand from the 3' end with L-exonuclease, is degraded. This results in a single-stranded region in the region of the insert which is suitable for hybridization with nucleic acids to be detected, and a double-stranded region remains to which a cross-linking compound can be covalently bound. Deviating from this, however, it is also possible to clone nucleic acids into a single-stranded phage (for example Ml3) and then double-stranded vector regions according to the method of Hu and Messing, Gene 17 / 271-277 (1982), ' or Courage-Tebbe and Ke per, Biochim.Biophys. A. 697, 1-5 (1982), but the inserts remain single-stranded.
Nach Vorbereitung des Nukleinsäureteils der Sonde wird die quervernetzende Verbindung, die bevorzugt eine zwi¬ schen einen DNA-Doppelstrang interkalierende Verbindung ist, mit der DNA inkubiert und dann die kovalente Ver¬ bindung mit der DNA bewirkt. Bevorzugt wird hierfür ein Psoralen oder ein Phenantridiumdiazid verwendet und die kovalente Bindung an die Nukleinsäuresonde durch Be¬ strahlung mit UV-Licht bewirkt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird hierfür Mitomycin C oder Carcinophilin A verwendet und die kovalente Bin¬ dung an die Nukleinsäuresonde durch Ansäuern der Reak¬ tionslösung bewirkt.After preparation of the nucleic acid part of the probe, the cross-linking compound, which is preferably a compound intercalating between a DNA double strand, is incubated with the DNA and the covalent connection with the DNA is then effected. A psoralen or a phenantridium diazide is preferably used for this and the covalent binding to the nucleic acid probe is effected by irradiation with UV light. In a further preferred embodiment, mitomycin C or carcinophilin A is used for this and the covalent binding to the nucleic acid probe is effected by acidifying the reaction solution.
Die quervernetzende Verbindung enhält bevorzugt als funktionelle Gruppe eine Amino-, Thiol-, Hydroxy- oder - 3 -The cross-linking compound preferably contains an amino, thiol, hydroxy or as a functional group - 3 -
Carboxygruppe. An diese funktionelle Gruppe v/ird sodann der Chelatbildner, der eine zur Reaktion mit einer funktioneilen Gruppe aktivierte Gruppe enthält, ange¬ bracht. Dieser Chelatbildner ist bevorzugt caDPTA, das gemischte Anhydrid von DTPA und Isobutylcarboxyσarbon- säure, 1-(p-Isolthioσyanatophenyl) -DTPA, 1-(p-Isothio- σyanatophenyl)-EDTA, 1-(p-Diazophenyl) -EDTA oder ein Phenylazid-Derivat von DTPA oder EDTA.Carboxy group. The chelating agent, which contains a group activated for reaction with a functional group, is then attached to this functional group. This chelating agent is preferably caDPTA, the mixed anhydride of DTPA and isobutylcarboxylic acid, 1- (p-isolothioσyanatophenyl) DTPA, 1- (p-isothio-σyanatophenyl) EDTA, 1- (p-diazophenyl) EDTA or a phenyl azide - derivative of DTPA or EDTA.
Weiter wird jedoch unter einem Chelatbildner im Sinne der Erfindung auch ein Kryptat verstanden. Bevorzugt wird hierbei ein Kryptat aus 0<,</-Bipyridin- oder 1,10- Phenantrolin-Einheiten eingesetzt. Es ist hierbei ebenfalls bevorzugt, Kryptate zu verwenden, die bereits fluorogene Metallionen enthalten, wobei die fluorogenen Metallionen wiederum bevorzugt Ionen der seltenen Erd¬ metalle sind. Besonders bevorzugt werden Kryptate ver¬Furthermore, a chelating agent in the sense of the invention is also understood to mean a cryptate. A cryptate composed of 0 <, </ - bipyridine or 1,10-phenantroline units is preferably used here. It is also preferred here to use cryptates which already contain fluorogenic metal ions, the fluorogenic metal ions in turn preferably being ions of the rare earth metals. Cryptates are particularly preferred
* «4- ^-t- " i wweennddeett,, ddiiie bereits Eu -, Tb - oder/und Sm -Ionen enthalten. * "4- ^ -t-" i wweennddeett ,, that already contain Eu, Tb or / and Sm ions.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform bringt man zwischen die quervernetzende Verbindung und den Chelatbildner zusätzlich ein Linkermolekül ein. Dieses Linkermolekül wird mit den funktioneilen bzw. aktivier¬ ten Gruppen der quervernetzenden Verbindung und des Chelatbildners umgesetzt. Hierzu ist es bevorzugt, ein Linkermolekül zu verwenden, das ein bifunktionelles Vernetzungsreagens darstellt. Besonders bevorzugt wird als Linkermolekül ein heterobifunktionelles Vernet¬ zungsreagens verwendet, also ein Vernetzungsreagens, das zwei verschiedene funktionelle Gruppen enthält, beispielsweise 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-car- bonsäure-N-hydroxysuccinimidester. In noch einer weite¬ ren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bringt man zwischen die quervernetzende Verbindung bzw. gegebe- nenfalls das Linkermolekül und den Chelatbildner zu¬ zusätzlich ein makromolekulares Trägermolekül mit min- mindestens einer funktioneilen Amino- oder Thiolgruppe ein. Hierdurch wird es ermöglicht, mehrere Chelatbild¬ ner an eine quervernetzende Verbindung, die wiederum an die Nukleinsäuresonde gekoppelt ist, zu binden. Hier¬ durch werden vermehrt Chelatbildnermoleküle für fluoro¬ gene Metallionen zur Verfügung gestellt, wodurch das später zu erhaltende Nachweissignal verstärkt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung verwen¬ det man als Trägermolekül ein homopolymeres oder hetero- polymeres Polypeptid, besonders bevorzugt Polylysin oder Polyc stein.In a further preferred embodiment, a linker molecule is additionally introduced between the crosslinking compound and the chelating agent. This linker molecule is reacted with the functional or activated groups of the cross-linking compound and the chelating agent. For this purpose, it is preferred to use a linker molecule which is a bifunctional crosslinking reagent. A heterobifunctional crosslinking reagent, that is to say a crosslinking reagent which contains two different functional groups, for example 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid N-hydroxysuccinimide ester, is particularly preferably used as the linker molecule. In yet another preferred embodiment of the invention, one brings between the cross-linking connection or if necessary, the linker molecule and the chelating agent additionally include a macromolecular carrier molecule with at least one functional amino or thiol group. This makes it possible to bind several chelating agents to a cross-linking compound, which in turn is coupled to the nucleic acid probe. As a result, chelating molecules are increasingly made available for fluorogenic metal ions, as a result of which the detection signal to be obtained later is amplified. In a preferred embodiment of the invention, a homopolymeric or heteropolymeric polypeptide, particularly preferably polylysine or polystyrene, is used as the carrier molecule.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein anderes Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäuresonde, die eine zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementäre Sequenz enthält, bei dem man eine Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 mit einer Einzelstrang-DNS oder RNS, die die für die Nachweishybridisierung erforderliche Sequenz und einen homopolymeren Einzelstrang, der zu der Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 komplementär ist, enthält, hybridisiert.Another object of the invention is another method for producing a nucleic acid probe which contains a sequence complementary to a nucleic acid to be detected, in which a nucleic acid probe according to claim 3 with a single-stranded DNA or RNA, the sequence required for detection hybridization and a homopolymer Single strand, which is complementary to the nucleic acid probe according to claim 3, contains hybridized.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfah¬ ren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäuresonde unter Ausbildung eines Hy- briddόppelstrangs, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresonde, welche die zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementäre Sequenz enthält, verwendet, nach erfolgter Hybridisierung eine Lösung eines fluorogenen Metallions zugibt und nach Entfernen der Metallionenlösung und Waschen den gebildeten Hybriddoppelstrang über die Fluoreszenz der I - \ ι -The invention further relates to a method for the detection of nucleic acids by hybridization with a nucleic acid probe to form a hybrid double strand, which is characterized in that a nucleic acid probe according to the invention which contains the sequence complementary to a nucleic acid to be detected is used after hybridization, a solution of a fluorogenic metal ion is added and, after removing the metal ion solution and washing, the hybrid double strand formed is exposed to the fluorescence of the I - \ ι -
am Chelatbildner gebundenen Metallionen nachweist.metal ions bound to the chelating agent.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäuresonde unter Ausbildung eines Hybrid- doppeistrangs, bei dem man eine Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 bis 15 verwendet, diese entweder zuerst mit einer Einzelstrang-DNS oder RNS, die die zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure komplementäre Sequenz und einen homopolymeren Nukleinsäureschwanz, der mit dem homopolymeren Einzelstrang der Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 komplementär ist, enthält, und gleichzeitig oder danach mit der nachzuweisenden Nukleinsäuresonde hybridisiert, nach erfolgter Hybridisierung eine Lösung eines fluorogenen Metallions zugibt und nach Entfernen der Metallionenlösung und Waschen die gebundenen Metall¬ ionen durch eine Verstärkerlösung extrahiert und den gebildeten Hybriddoppelstrang über die Fluoreszenz der Metallionen in der Verstärkerlösung nachweist.Another object of the invention is a method for the detection of nucleic acids by hybridization with a nucleic acid probe to form a hybrid double strand, in which one uses a nucleic acid probe according to claim 3 to 15, this either with a single-stranded DNA or RNA which the a nucleic acid complementary sequence to be detected and a homopolymeric nucleic acid tail, which is complementary to the homopolymeric single strand of the nucleic acid probe according to claim 3, and simultaneously or thereafter hybridizes with the nucleic acid probe to be detected, adds a solution of a fluorogenic metal ion after hybridization and after removing the metal ion solution and Washing the bound metal ions is extracted by an amplifier solution and the hybrid double strand formed is detected via the fluorescence of the metal ions in the amplifier solution.
Als fluorogene Metallionen werden bevorzugt Ionen der seltenen Erden verwendet. Besonders bevorzugt sindRare earth ions are preferably used as the fluorogenic metal ions. Are particularly preferred
"3 - *3 -i- ^-J- hierbei Eu , Tb oder Sm"3 - * 3 -i- ^ -J- here Eu, Tb or Sm
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Hybridisierung mit einer auf einem Träger, beispiels¬ weise auf einem Filter, Gel, Mikrotiterplatte, histolo- gischen.Schnitt, Zelle gebundenen nachzuweisenden Nukleinsäure durchgeführt, nach erfolgter Hybridisie¬ rung die fluorogenen Metallionen zugegeben und nach Waschen zur Entfernung überschüssiger nicht komplexierter Metallionen, die Metallionen durch eine Verstärkerlösung vom Komplex abgelöst und ihre Fluoreszenz in der verstärk¬ ten Lösung bestimmt. Zur optimalen Fluoreszenzanregung ist es nämlich zweckmäßig, die Metallionen -aus dem Chelatkomplex mit einer speziellen Verstärkerlösung eines nichtionischen Detergens (0,1 - 0,05 %, v/v, z.B. Triton) , einer "synergistischen Base" (10 - 100 μM, z.B. 50 μM Tri-n-octylphosphinoxid) und einem Energie-Donor (10 μM - 100 μM eines ß-Diketons, z.B. 15 μM 2-Naphtoyltrifluoroaceton) in einer wäßrigen Pufferlösung mit einem pH-Wert zwischen 2,5 und 4 herauszulösen. Eine bevorzugte Verstarkerlösung enthält 0,1 M Acetat-Phthalat-Puffer, pH 3,2, 0,1% Triton X-100 (v/v) , 15 μM 2-Naphthoyltrifluoroaceton und 50 μM Tri-n-octylphosphinoxid.In a preferred embodiment of the invention, the hybridization is carried out with a nucleic acid to be detected, which is bound on a support, for example on a filter, gel, microtiter plate, histological section, cell, the fluorogenic metal ions are added after hybridization has taken place and after washing to remove excess uncomplexed metal ions, the metal ions are detached from the complex by an intensifying solution and their fluorescence in the amplified solution is determined. For optimal fluorescence excitation, it is in fact advisable to remove the metal ions from the Chelate complex with a special amplifier solution of a non-ionic detergent (0.1 - 0.05%, v / v, e.g. Triton), a "synergistic base" (10 - 100 μM, e.g. 50 μM tri-n-octylphosphine oxide) and an energy Dissolve donor (10 μM - 100 μM of a β-diketone, eg 15 μM 2-naphthoyltrifluoroacetone) in an aqueous buffer solution with a pH between 2.5 and 4. A preferred strengthening solution contains 0.1 M acetate phthalate buffer, pH 3.2, 0.1% Triton X-100 (v / v), 15 μM 2-naphthoyltrifluoroacetone and 50 μM tri-n-octylphosphine oxide.
Bei Anwendung gewöhnlicher Hybridisierungsbedingungen (Temperatur über 60 °C bzw. um 40 °C in Gegenwart von 50 % Formaldehyd) kann die mit den Chelatliganden mar¬ kierte Nukleinsäuresonde nicht bereits metallgebunden eingesetzt werden, da die Metallionen unter diesen Be¬ dingungen vom Chelat abdissoziieren würden. Folglich werden die Metallionen erst nach erfolgter Hybridisie- rungsreaktion zugegeben. Eine Ausnahme hierbei sind je¬ doch milde Hybridisierungsbedingungen, bei denen auch eine mit Metallionen vormarkierte Nukleinsäuresonde eingesetzt werden kann.If normal hybridization conditions are used (temperature above 60 ° C. or around 40 ° C. in the presence of 50% formaldehyde), the nucleic acid probe labeled with the chelate ligands cannot already be used in a metal-bound manner since the metal ions would dissociate from the chelate under these conditions . Consequently, the metal ions are only added after the hybridization reaction has taken place. An exception to this are, however, mild hybridization conditions in which a nucleic acid probe pre-labeled with metal ions can also be used.
Die Bestimmung der Fluoreszenz der Metallionen nach Entfernung aus dem markierten Hybriddoppelstrang in Lö¬ sung stellt vor allem dann einen Vorteil dar, wenn bei¬ spielsweise im Rahmen der klinischen und medizinischen Anwendungen das erfindungsgemäße Verfahren angewandt wird.Hierbei können nämlich die nachzuweisenden Nukleinsäuren oft nicht in gereinigter Form benutzt v/erden, sondern es sind noch Verunreinigungen aus biologischem Begleitmaterial, wie Zellen, Gewebe u.a., anwesend. Hierdurch kann sich eine Störung der Messung ergeben, die jedoch durch Herauslösen der fluoreszieren- - . 3 -The determination of the fluorescence of the metal ions after removal from the labeled hybrid double strand in solution is above all an advantage if, for example, the method according to the invention is used in the context of clinical and medical applications, since the nucleic acids to be detected can often not be used in this way clean form used, but there are still contaminants from accompanying biological material, such as cells, tissues, etc., present. This can result in a disturbance in the measurement, but this can be caused by removing the fluorescent -. 3 -
den Metallionen aus dem Hybriddoppelstrang und der Bestimmung in dieser Lösung, dem hierzu idealen Medium, vermieden wird. Es wird also auch eine Bestimmung von Nukleinsäuren in Blut, Zellen und Gewebe nach entspre¬ chender Fixierung ermöglicht.the metal ions from the hybrid double strand and the determination in this solution, the ideal medium for this, is avoided. A determination of nucleic acids in blood, cells and tissue after corresponding fixation is also made possible.
Ein weiterer Vorteil, der sich durch das Herauslösen der Metallionen aus dem markierten Hybriddoppelstrang ergibt, ist, daß man bei kleinen Mengen von am Hybrid¬ strang gebundenen Metallionen die Lösung der Ionen noch konzentrieren und dadurch eine genauere Messung erzielen kann.Another advantage that results from the removal of the metal ions from the marked hybrid double strand is that, with small amounts of metal ions bound to the hybrid strand, the solution of the ions can still be concentrated and a more precise measurement can thereby be achieved.
Bei der Chelatisierung werden die Metallionen zweck¬ mäßigerweise selbst in Form eines Komplexes zugegeben. Die Komplexbildungskonstante dieses Komplexes sollte auch relativ hoch sein (log K mindestens 5) , jedoch wesentlich geringer als diejenige des Metallions gegenüber dem an der Sonde gebundenen Chelatbildner. Dies verhindert eine unspezifische Bindung des Metall¬ ions an andere Bindungsstellen, wie Phosphatgruppen der Nukleinsäuren oder Bindungsstellen auf dem Filter usw.In the chelation, the metal ions are expediently added even in the form of a complex. The complex formation constant of this complex should also be relatively high (log K at least 5), but significantly lower than that of the metal ion compared to the chelating agent bound to the probe. This prevents non-specific binding of the metal ions to other binding sites, such as phosphate groups of the nucleic acids or binding sites on the filter, etc.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäuresonde unter Ausbildung eines Hybrid¬ doppelstrangs, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresonde verwendet, die als Chelatbildner ein Kryptat enthält, das bereits ein fluorogenes Metallion enthält. Bei Kryptaten von Metall¬ ionen ist nämlich nicht zu befürchten, daß die Metalli¬ onen bei den verwendeten Hybridisierungsbedingungen aus dem Kryptat abdissoziieren. Hierbei kann die Fluores¬ zenz der Metallionen nach erfolgter Hybridisierung auch direkt am Hybriddoppelstrang bestimmt werden. Es wird ~ ) HAnother object of the invention is a method for the detection of nucleic acids by hybridization with a nucleic acid probe to form a hybrid double strand, which is characterized in that a nucleic acid probe according to the invention is used which contains a cryptate as chelating agent which already contains a fluorogenic metal ion. In the case of cryptates of metal ions, there is no fear that the metal ions will dissociate from the cryptate under the hybridization conditions used. The fluorescence of the metal ions can also be determined directly on the hybrid double strand after hybridization has taken place. It will ~) H
hierdurch also ein in-situ-Nachweis über die Fluores¬ zenz der Metallionen am Hybriddoppelstrang ermöglicht. Dieses Verfahren erscheint daher auch besonders für Hybridisierungen mit zellulärem Material geeignet.this enables in-situ detection of the fluorescence of the metal ions on the hybrid double strand. This process therefore also appears to be particularly suitable for hybridizations with cellular material.
Erfindungsgemäß wird also eine Nukleinsäuresonde und ein Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren bereitge¬ stellt, das es ermöglicht, ohne Verwendung von radio¬ aktiven Verbindungen bzw. enzymatisch oder immunolo¬ gisch markierten Sonden Nukleinsäuren mit hoher Spezi- fität nachzuweisen. Besonders die Verwendung eines Trä¬ germoleküls, an das mehrere Chelatbildner gebunden wer¬ den können, wodurch eine Verstärkung des Signals von fluorogenen Metallionen erhalten wird, bewirkt eine hohe Sensitivität des erfindungsgemäßen Verfahrens. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung in Ver¬ bindung mit den Figuren weiter.According to the invention, a nucleic acid probe and a method for the detection of nucleic acids are thus provided which make it possible to detect nucleic acids with high specificity without using radioactive compounds or enzymatically or immunologically labeled probes. In particular, the use of a carrier molecule to which several chelating agents can be bound, which results in an amplification of the signal from fluorogenic metal ions, results in a high sensitivity of the method according to the invention. The following examples further explain the invention in conjunction with the figures.
Fig. 1 zeigt schematisch die Synthese von Psoralen-SH; Fig. 2 zeigt das Elutionsprofil einerFigure 1 shows schematically the synthesis of psoralen SH; Fig. 2 shows the elution profile of a
DEAE-Chromatographie eines DTPA-PLL-pKKHBs34'-DEAE chromatography of a DTPA-PLL-pKKHBs34'-
Konjugats; und Fig. 3 zeigt die Fluoreszenzbestimmung vonConjugate; and Fig. 3 shows the fluorescence determination of
Europium-Ionen nach Ablösung vom Chelatbildner.Europium ions after detachment from the chelating agent.
Beispiel 1example 1
-Synthese eines Thiol enthaltenden Psoralens (PSH) .-Synthesis of a thiol-containing psoralens (PSH).
Psoralen-SH wurde gemäß der Methode von Saffran et al, Proc.Natl.Acad.Sci.üSA 79, 4594-4598 (1982), herge¬ stellt. Die einzelnen Reaktionsschritte der Synthese sind in Figur 1 dargestellt. Alle Reaktionen wurden im Dunklen durchgeführt. la) Herstellung von 4'-Chloromethyl-4,5 ' ,8-trimethyl- psoralen (2) :Psoralen-SH was produced according to the method of Saffran et al, Proc.Natl.Acad.Sci.üSA 79, 4594-4598 (1982). The individual reaction steps of the synthesis are shown in Figure 1. All reactions were carried out in the dark. la) Preparation of 4'-chloromethyl-4,5 ', 8-trimethyl-psoralen (2):
Eine Lösung von 2 % S0C1- in trockenem ChloroformA solution of 2% S0C1- in dry chloroform
(40 ml) wurde tropfenweise zu 4 '-Hydroxymethyl- 4,5'-8-trimethylpsoralen (15 mg, 5,8*10 -5 mol) in¬ nerhalb von 5 Minuten unter Raumtemperatur zugege¬ ben. Nach zusätzlichem Rühren während weiterer drei. Stunden bei Raumtemperatur wurde eine Dünnschicht¬ chromatographie (TLC) auf Silicagel durchgeführt und das Ende der Reaktion überprüft. Das Lösungs¬ mittel und die gasförmigen Komponenten wurden unter reduziertem Druck entfernt. Das Produkt 2 mit einem R -Wert von 0,41 auf Silicagel TLC (1:1, Petrol- äther - Ethylacetat) wurde ohne weitere Reinigung weiterverwende .(40 ml) was added dropwise to 4'-hydroxymethyl-4,5'-8-trimethylpsoralen (15 mg, 5.8 * 10 -5 mol) within 5 minutes under room temperature. After additional stirring for another three. For hours at room temperature, thin-layer chromatography (TLC) was carried out on silica gel and the end of the reaction was checked. The solvent and the gaseous components were removed under reduced pressure. Product 2 with an R value of 0.41 on silica gel TLC (1: 1, petroleum ether - ethyl acetate) was used without further purification.
lb) Herstellung von 4 *-(9"-Amino-2",6"-diazanonyl) - 4,5' ,8-trimethylpsoralen (3):lb) Preparation of 4 * - (9 "-amino-2", 6 "-diazanonyl) - 4,5 ', 8-trimethylpsoralen (3):
Eine Lösung der Verbindung 2 (16 mg, 5,8*10 mol) und N,N-Bis-(diaminopropyl)-aminomethan (150 mg, 180 μl, 9,6*10~4 mol) in trockenem Toluol (10 ml) wurde unter Rückfluß acht Stunden lang erhitzt. Das Lösungsmittel wurde dann im Vakuum entfernt und der Rest einer Chromatographie auf Aluminiumoxid unter¬ worfen (7:2:1, Ethylacetat - Methanol - Wasser), woraus sich das Produkt 3 ergab (7,3 mg, 33 %) , ein orangebraunes 'öl mit einem R£-Wert von 0,16 auf Aluminiumoxid TLC (7:2:1, Ethylacetat - Methanol - Wasser). ^Ε-NMR (90 Mhz, CDC13) •T 7,62 (1H, s, Phenyl) , 6,23 (1H, s, Lacton) , 3,86 (2H, s, Ar-CH«- NHR) , 2,42,55 (14H, , 8H RR'N-CI^-, 3H Ar-CH3 , 3H Furan-CH3, 3H Pyron-CH3, 2,18 (3H, s, N-CH3) , 1,70 (4H, m, -CH2-CH2-CH2-) . - \ b -A solution of compound 2 (16 mg, 5.8 * 10 mol) and N, N-bis (diaminopropyl) aminomethane (150 mg, 180 μl, 9.6 * 10 ~ 4 mol) in dry toluene (10 ml ) was heated under reflux for eight hours. The solvent was then removed in vacuo and the remainder subjected to chromatography on aluminum oxide (7: 2: 1, ethyl acetate - methanol - water), from which the product 3 resulted (7.3 mg, 33%), an orange-brown ' oil with an R £ value of 0.16 on aluminum oxide TLC (7: 2: 1, ethyl acetate - methanol - water). ^ Ε NMR (90 MHz, CDC1 3 ) • T 7.62 (1H, s, phenyl), 6.23 (1H, s, lactone), 3.86 (2H, s, Ar-CH «- NHR) , 2,42,55 (14H,, 8H RR'N-CI ^ -, 3H Ar-CH 3 , 3H Furan-CH 3 , 3H Pyron-CH 3 , 2,18 (3H, s, N-CH 3 ) , 1.70 (4H, m, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -). - \ b -
lc) Herstellung von 4'-(9π-(3' ' '-(2""-Pyridyldithio)- propionamido)-2",6"-diazanonyl)-4,5 ' ,8-trimethyl- psoralen (4) :lc) Preparation of 4 '- (9 π - (3''' - (2 "" - pyridyldithio) - propionamido) -2 ", 6" -diazanonyl) -4,5 ', 8-trimethyl-psoralen (4) :
Eine Lösung von N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)- propionat (6 mg, 1,9*10 mol) in trockenem Me¬ thylenchlorid (100 μl) wurde zu der Verbindung 3 (7,4 mg, 1,9*10 mol) in trockenem Methylenchlorid (100 μl) zugegeben. Nach 30-minütigem Rühren bei Raumtemperatur in dem Lösungsmittel wurde im Vakuum eingedampft und der verbleibende Rest auf Alumini¬ umoxid (Methanol) chromatographiert, wobei sich das Produkt 4 (4,35 mg, 40 %) mit einem R--Wert von 0,79 (Aluminiumoxid TLC, 7:2:1, Ethylacetat - Me¬ thanol - Wasser) als weißer amorpher Feststoff bil¬ dete. 1H-NMR (90 Mhz, CDC13) (T 8,45 (IH, m, Pyri¬ din 3H) , 7,67,7 (3H, m, 1 Phenyl-H, Pyridin 5,6H), 7,11 (IH, m, Pyridin 4H) , 6,52 (IH, s, Lacton), 3,9 (2H, s, Ar-CH2-NHR) , 3,11 (2H, s, C0CH2) , 2,84 (2H, s, -CH2-S-) , 2,452,55 (14H, m, 8H R,R*N-CH2, 3H Ar- CH3) , 3H Furan-CH3, 3H Pyron-CH3) , 2,17 (3H, s, N- CH3), 1,70 (4H, m, -CH2-CH2-CH2-) . UV (Methanol) λ- IϊlclX ( 285 (5,600) 330 (1,900) nm.A solution of N-succinimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate (6 mg, 1.9 * 10 mol) in dry methylene chloride (100 μl) was added to compound 3 (7.4 mg, 1.9 * 10 mol) in dry methylene chloride (100 μl) added. After stirring for 30 minutes at room temperature in the solvent, the mixture was evaporated in vacuo and the remainder was chromatographed on aluminum oxide (methanol), the product 4 (4.35 mg, 40%) having an R value of 0. 79 (aluminum oxide TLC, 7: 2: 1, ethyl acetate-methanol-water) formed as a white amorphous solid. 1 H-NMR (90 MHz, CDC1 3 ) (T 8.45 (IH, m, pyridine 3H), 7.67.7 (3H, m, 1 phenyl-H, pyridine 5.6H), 7. 11 (IH, m, pyridine 4H), 6.52 (IH, s, lactone), 3.9 (2H, s, Ar-CH 2 -NHR), 3.11 (2H, s, COCH 2 ), 2 , 84 (2H, s, -CH 2 -S-), 2,452.55 (14H, m, 8H R, R * N-CH 2 , 3H Ar-CH 3 ), 3H furan-CH 3 , 3H pyrone-CH 3 ), 2.17 (3H, s, N-CH 3 ), 1.70 (4H, m, -CH 2 -CH 2 -CH 2 -). UV (methanol) λ- IϊlclX (285 (5,600) 330 (1,900) nm.
ld) Herstellung von 4'-(9"-(3 ' ' '-Mercaptopropionamido)- 2",6"-diazanonyl)-4 5' ,8-trimethylpsoralen (5) (PSH) :ld) Preparation of 4 '- (9 "- (3" "- mercaptopropionamido) - 2", 6 "-diazanonyl) -4 5', 8-trimethylpsoralen (5) (PSH):
PSH (5) wurde für jede Markierungsreaktion frisch hergestellt. 24 μl von einer 1,7 mM-Vorratslösung der Verbindung 4 in Ethanol, 40μl 100 mM Dithioery- thritol (DTE)und 16 μl H20 wurden in einem Eppen- dorf-Gefäß gemischt und eine Stunde bei Raumtempe¬ ratur im Dunklen inkubiert. - / -PSH (5) was freshly made for each labeling reaction. 24 μl of a 1.7 mM stock solution of compound 4 in ethanol, 40 μl 100 mM dithioerythitol (DTE) and 16 μl H 2 O were mixed in an Eppendorf vessel and incubated for one hour at room temperature in the dark . - / -
Beispiel 2Example 2
Modifikation von klonierter DNA.Modification of cloned DNA.
9 μg des Plasmids pKKHBs34 j ang et al, ΞxMBO J. 1_, 1213-1216 (1982h Valenzuela et al. , 1980 in Fields, Jaenisch und Fox (Herausgeber) , ICN-UCLA Symposium on Moleσular and Cellular Biology XVIII, Ani al Virus Genetics, Academic Press, NY, S. 57-70) wurden mit der Restriktionsendonukle ase Hpa I (10 U) in 25 μl 10 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, 10 M MgCl2, 5 mM Mercaptoethanol (pH 7,5) eine Stunde bei 37 °C inkubiert, um das Plasmid zu linearisieren. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2,5 μl 100 mM EDTA beendet. Die DNA wurde mit Ethanol gefällt, mit 70%igem Ethanol gewaschen und in 36 μl H_0 resuspendiert. Dazu wurde Exonuklease III (90 U) in 4 μl 10xExo-III-Puffer (660 mM Tris-HCl, 6,6 mM MgCl2, 10 mM Mercaptoethanol, pH 7,6) zugegeben-und die Lösung bei 37 °C 30 Minuten lang inkubiert, um das Plasmid teilweise einzelsträngig zu machen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 μl 100 mM EDTA beendet. Das teil¬ weise einzelsträngige pKKHBs34 (im folgenden pKKHBs34' genannt) wurde von En zym, Nukleotiden und Puffer über eine NENSORB-20-Nukleinsäure-Reinigungspatrone gemäß den Instruktionen des Herstellers getrennt.9 μg of the plasmid pKKHBs34 j ang et al, ΞxMBO J. 1_, 1213-1216 (1982h Valenzuela et al., 1980 in Fields, Jaenisch and Fox (editor), ICN-UCLA Symposium on Molecular and Cellular Biology XVIII, Ani al Virus Genetics, Academic Press, NY, pp. 57-70) were restricted with the restriction endonucleus Hpa I (10 U) in 25 ul 10 mM Tris-HCl, 50 mM KC1, 10 M MgCl 2 , 5 mM mercaptoethanol (pH 7.5 ) incubated at 37 ° C for one hour to linearize the plasmid. The reaction was stopped by adding 2.5 ul 100 mM EDTA. The DNA was precipitated with ethanol, washed with 70% ethanol and resuspended in 36 μl H_0. For this, exonuclease III (90 U) in 4 μl 10xExo-III buffer (660 mM Tris-HCl, 6.6 mM MgCl 2 , 10 mM mercaptoethanol, pH 7.6) was added and the solution at 37 ° C. for 30 minutes long incubated to make the plasmid partially single-stranded. The reaction was stopped by adding 5 ul 100 mM EDTA. The partially single-stranded pKKHBs34 (hereinafter referred to as pKKHBs34 ') was separated from the enzyme, nucleotides and buffer via a NENSORB-20 nucleic acid cleaning cartridge in accordance with the manufacturer's instructions.
Beispiel 3Example 3
Markierung der DNA-Probe mit dem Thiol enthaltendenLabel the DNA sample with the thiol-containing one
Psoralen PSH .Psoralen PSH.
Psoralen-Moleküle interkalieren in doppelsträngige DNA und unterliegen einer Photocycloaddition mit DNA-Thymi- dinresten bei Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht (Cimino et al, Ann.Rev.Bochem. 5_4, 1151-1193 (1985)) . Querverbindungen zwischen zwei Thymidinresten in einem - I S -Psoralen molecules intercalate into double-stranded DNA and undergo photocycloaddition with DNA thymidine residues when irradiated with long-wave UV light (Cimino et al, Ann.Rev.Bochem. 5_4, 1151-1193 (1985)). Cross-connections between two thymidine residues in one - IS -
Doppelstrang werden bei TA/AT-Sequenzen leicht gebil¬ det, Einzelstrang-DNA bleibt unmodifiziert.Double strands are easily formed in TA / AT sequences, single strand DNA remains unmodified.
Für die Photomarkierungsreaktion wurden 20 μl frisch hergestelltes PSH (Verbindung 5, 0,51 mM in 50 mM DTE) zu einer Lösung von 7,5 μg pKKHBs34' in 180 μl 10 M Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7,15) zugegeben. Dies ent¬ spricht einem Verhältnis von Psoralen zu Basenpaaren von ungefähr 1:1. Die Lösung wurde 15 Minuten bei Raum¬ temperatur im Dunklen inkubiert, um eine Interkalation zu erreichen, und dann zwei Stunden bei 0 °C in einer 3 mm dicken Flüssigschicht mit UV-Licht zwischen 300 und 400 nm bestrahlt (HBO 200 W Hochdruck-Quecksilber¬ lampe, Zeiss, Oberkochen, BRD; UGl-Filter, Schott, Mainz, BRD) . Zugabe von neuem PSH und Bestrahlung wur¬ den zweimal durchgeführt, um eine höhere Markierungs¬ rate zu erreichen. Überschüssiges freies Psoralen und Photoabbauprodukte wurden durch Extraktion der Reak¬ tionsmischung einmal in 1 vol Phenol und einmal in 1 vol Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) entfernt. Schließlich wurde die DNA mit Ethanol gefällt und mit 70%igem Ethanol gewaschen.For the photo-labeling reaction, 20 μl of freshly prepared PSH (compound 5, 0.51 mM in 50 mM DTE) were added to a solution of 7.5 μg pKKHBs34 'in 180 μl 10 M Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 7.15) admitted. This corresponds to a ratio of psoralen to base pairs of approximately 1: 1. The solution was incubated for 15 minutes at room temperature in the dark in order to achieve an intercalation, and then irradiated for two hours at 0 ° C. in a 3 mm thick liquid layer with UV light between 300 and 400 nm (HBO 200 W high-pressure mercury ¬ lamp, Zeiss, Oberkochen, FRG; UGl filter, Schott, Mainz, FRG). The addition of new PSH and irradiation were carried out twice in order to achieve a higher labeling rate. Excess free psoralen and photodegradation products were removed by extraction of the reaction mixture once in 1 vol phenol and once in 1 vol chloroform-isoamyl alcohol (24: 1). Finally, the DNA was precipitated with ethanol and washed with 70% ethanol.
Die kovalente Querverbindung der komplementären Stränge in der DNA wurde durch einen Ethidiumbromid-Fluores- zenztest gezeigt (Morgan und Peatkau, Can.J.Biochem. 5 , 210-217 (1972) ) .The covalent cross-linking of the complementary strands in the DNA was demonstrated by an ethidium bromide fluorescence test (Morgan and Peatkau, Can. J. Biochem. 5, 210-217 (1972)).
Die Menge von PSH, die kovalent an die DNA gebunden ist, wurde durch Reaktion der SH-Gruppen mit dem Thiol-spezifischen Fluoreszenz-Farbstoff, 7-Di-ethyl- amino-3-(4'-maleimidophenyl)-4-methylcumarin (CPM) , bestimmt. Die Fluoreszenz von CPM wird besträchtlich erhöht, wenn es kovalent an Thiol-Gruppen gebunden wird. SH- arkiertes pKKHBs34* (7,5 μg) wurde in 50 μl 50 mM Phosphat-Puffer (pH 7,8), enthaltend 200 μM CPM und 1 mM EDTA, gelöst. Die Mischung wurde zwei Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und dann 10 μl Probe zu nun 990 μl 1 % Triton X-100 (v/v in Wasser) zugegeben und die Fluoreszenz in dem LS-5-Spektrofluorometer (Ex 390 nm, Em 465 nm) gemessen. Eine Fluoreszenz-Eich¬ kurve wurde mit N-acetyl-Cystein mit Konzentrationen zwischen 0,1 und 250 μM aufgestellt.The amount of PSH covalently bound to the DNA was determined by reacting the SH groups with the thiol-specific fluorescent dye, 7-di-ethylamino-3- (4'-maleimidophenyl) -4-methylcoumarin ( CPM). The fluorescence of CPM is significantly increased when it is covalently bound to thiol groups. SH-labeled pKKHBs34 * (7.5 μg) was in 50 μl 50 mM phosphate buffer (pH 7.8) containing 200 μM CPM and 1 mM EDTA, dissolved. The mixture was shaken at room temperature for two hours and then 10 μl sample was added to 990 μl 1% Triton X-100 (v / v in water) and the fluorescence in the LS-5 spectrofluorometer (Ex 390 nm, Em 465 nm) measured. A fluorescence calibration curve was established with N-acetyl-cysteine at concentrations between 0.1 and 250 μM.
Kontrollreaktionen mit markierter DNA in Anwesenheit von HgCl2 (100 μM) und unmodifizierter DNA (die mit Ausnahme der Photoreaktion wie die markierte DNA behan¬ delt wurde) ergaben die Background-Fluoreszenz.Control reactions with labeled DNA in the presence of HgCl 2 (100 μM) and unmodified DNA (which, with the exception of the photoreaction, was treated like the labeled DNA) gave the background fluorescence.
Beispiel 4Example 4
Herstellung- von DTPA-gebundenem Poly-L-Lysin.Production of DTPA-bound poly-L-lysine.
Das zyklische Anhydrid von DTPA (caDTPA, 2,1 mg, 5,88 μmol) wurde, in Aliquoten zu einer Lösung von Poly-L- Lysin (PLL, M 17000, 0,5 mg, 29,4 n ol) in 50 μl 100 M KHCO- (pH 8,2) unter starkem Schütteln zugege¬ ben. Hierzu wurde genügend 3N NaOH zugegeben, um den pH der Lösung zwischen 7 und 8 zu halten. Es wurde keine Präzipitation von Addukten mit hohem Molekulargewicht beobachtet. Die Färbung mit Ninhydrin zeigte weniger, jedoch noch verbleibende freie Aminogruppen in der Probe.The cyclic anhydride of DTPA (caDTPA, 2.1 mg, 5.88 μmol), in aliquots, became a solution of poly-L-lysine (PLL, M 17000, 0.5 mg, 29.4 n ol) in 50 μl 100 M KHCO- (pH 8.2) added with vigorous shaking. Sufficient 3N NaOH was added to keep the pH of the solution between 7 and 8. No precipitation of high molecular weight adducts was observed. Staining with ninhydrin showed less, but still free amino groups in the sample.
Der DTPA-Gehalt in PLL wurde durch Gleichgewichtsdia¬ lyse bestimmt. DTPA-PLL-Konjugat (20 μg) wurde zwei Stunden mit 500 μM EuCl3, 500 μM EDTA in 200 μl 50 mM Nactriumcitrat-Puffer (pH 6,0) inkubiert und dann bis zum Gleichgewicht gegen 5 mM Natriumacetat, 10 mM NaCl (pH 5,5) dialysiert. Der Europium- und dadurch der DTPA-Gehalt wurde durch zeitverzögerte Fluorometrie be- stimmt.The DTPA content in PLL was determined by equilibrium dialysis. DTPA-PLL conjugate (20 μg) was incubated for two hours with 500 μM EuCl 3 , 500 μM EDTA in 200 μl 50 mM sodium citrate buffer (pH 6.0) and then equilibrated against 5 mM sodium acetate, 10 mM NaCl ( pH 5.5) dialyzed. The europium and thus the DTPA content was determined by time-delayed fluorometry Right.
Beispiel 5Example 5
Herstellung von DTPA-PLL-pKKHBs34 '-Konjugat.Preparation of DTPA-PLL-pKKHBs34 'conjugate.
DTP -gebundenes PLL (100 μg, 6 nmol) in 100 μl 100 mM KHCO-. (pH 8,2) wurde auf Eis gekühlt. Das heterobi- funktionelle Quervernetzungsmittel, 4-(N-Maleimido- methyl)-cyclohexan-1-carbonsäure-N-hydroxy-succinimid- ester (10 μgl, 30 nmol, aus einer 1 mg/ml-Lösung in trockenem Dimethylformamid) wurde langsam unter Schütteln zugegeben. Die Lösung wurde weitere 30 Minu¬ ten lang bei Raumtemperatur geschüttelt und nach Ein¬ stellen des pH auf 6,5 mit 0,6 N HCl mit SH-markiertem pKKHBs34' (7,5 μg) Übernacht bei Raumtemperatur inku¬ biert. Das resultierende Konjugat wurde durch DEAE- Chromatographie isoliert (Fig. 2) .DTP -bound PLL (100 μg, 6 nmol) in 100 μl 100 mM KHCO-. (pH 8.2) was cooled on ice. The heterobifunctional cross-linking agent, 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid N-hydroxy-succinimide ester (10 μg, 30 nmol, from a 1 mg / ml solution in dry dimethylformamide) became slow added with shaking. The solution was shaken for a further 30 minutes at room temperature and, after adjusting the pH to 6.5 with 0.6 N HCl, SH-labeled pKKHBs34 '(7.5 μg) was incubated overnight at room temperature. The resulting conjugate was isolated by DEAE chromatography (Fig. 2).
Beispiel 6Example 6
Dot-Blot-Hybridisierung mit DTPA-PLL-pKKHBs34 ' .Dot blot hybridization with DTPA-PLL-pKKHBs34 '.
pKKHBs34 als Ziel-DNA in verschiedenen Mengen und pBR322 und Kalbsthymus-DNA als Kontrollen wurden auf Nitrozellulosefilterscheiben (BA 85 NC-Filter, 4-5 mm Durchmesser, Schleicher und Schuell) immobilisiert und nach Standardmethoden denaturiert (Anderson and Young, in Harnes B.D. and Higgins (Herausg.) , Nucleic Acid . Hybridization; A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Washington, DC, 73-111 (1985)) . Die Filter wurden in einzelne Polystyrol-Mikrotiterplatten eingesetzt und bei 42 °C vier Stunden lang in 50 % deionisiertem Form- amid, 5x SSC (pH 7,0, lx SSC = 150 mM NaCl, 15 mM Na- triumcitrat) , 1 % Sarkosyl, 0,1 % Rinderserum-Albumin, 0,1 % Ficoll 400, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon und 250 μg/ ml denaturierte, beschallte Heringssperma-DNA vorhybri¬ disiert. Die Hybridisierung wurde 16 Stunden bei 42 °C - Z ) -pKKHBs34 as target DNA in various amounts and pBR322 and calf thymus DNA as controls were immobilized on nitrocellulose filter disks (BA 85 NC filter, 4-5 mm diameter, Schleicher and Schuell) and denatured using standard methods (Anderson and Young, in Harnes BD and Higgins (ed.), Nucleic Acid. Hybridization ; A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Washington, DC, 73-111 (1985)). The filters were placed in individual polystyrene microtiter plates and at 42 ° C for four hours in 50% deionized form amide, 5x SSC (pH 7.0, 1x SSC = 150mM NaCl, 15mM sodium citrate), 1% sarcosyl , 0.1% bovine serum albumin, 0.1% Ficoll 400, 0.1% polyvinylpyrrolidone and 250 μg / ml denatured, sonicated herring sperm DNA pre-hybridized. Hybridization was at 42 ° C for 16 hours - Z) -
mit der DTPA-markierten pKKHBs34'-Probe (500 ng/ml in der Vorhybridisierungslösung, welche 10 % Dextransulphat enthielt) durchgeführt. Die Filter wurden zweimal zehn Minuten bei Raumtemperatur in 2x SSC, 0,5 % Sarkosyl und drei mal 20 Minuten bei 50 °C in 0,lx SSC, 0,1 % Sarkosyl gewaschen.with the DTPA-labeled pKKHBs34 'sample (500 ng / ml in the prehybridization solution which contained 10% dextran sulphate). The filters were washed twice for ten minutes at room temperature in 2x SSC, 0.5% Sarkosyl and three times for 20 minutes at 50 ° C in 0.1X SSC, 0.1% Sarkosyl.
Beispiel 7Example 7
Chelatisierung von Europium und Quantifizierung durch zeitverzögerte Fluorometrie.Europium chelation and quantification by time-delayed fluorometry.
Eine Chelatisierung des hybridgebundenen DTPA mit Euro¬ pium-Ionen wurde durch Inkubation der Filter aus Beispiel 6 in 100 μM EuCl3, 100 μM EDTA, lx SSC (pH 7,0, 200 μl pro Mikrotiterplatte) zwei Stunden bei Raumtemperatur erreicht. Die Filter wurden mindestens sechsmal in 2x SSC gewaschen und schließlich 15 Minuten in 1 ml "Verstärkerlösung" (0,1 M Acetat-phthalat-Puf- fer, pH 3,2, 0,1 % Triton X- 100 (v/v), 15 μM 2-Naphtoyltrifluoroaceton, 50 μM Tri- n-octylpho'sphin- ■ oxid) in Polystyrol-Gefäßen geschüttelt, um DTPA-gebun- denes Eu 3+ zu entfernen. Der Überstand wurde abdekan¬ tiert und die Fluoreszenz in einem "Arcus 1230"-zeit¬ verzögerten Fluorometer (LKB-Wallac, Turku, Finnland) bestimmt. Excitation und Emission waren jeweils 340 und 613 nm. Verzogerungs- und Zählzeit wurden beide auf 400 μs gesetzt (Fig. 3) . Chelation of the hybrid-bound DTPA with European ions was achieved by incubating the filters from Example 6 in 100 μM EuCl 3 , 100 μM EDTA, 1 × SSC (pH 7.0, 200 μl per microtiter plate) for two hours at room temperature. The filters were washed at least six times in 2x SSC and finally for 15 minutes in 1 ml "booster solution" (0.1 M acetate phthalate buffer, pH 3.2, 0.1% Triton X-100 (v / v) , 15 μM 2-naphthoyltrifluoroacetone, 50 μM trin-octylpho'sphin ■ oxide) were shaken in polystyrene vessels to remove DTPA-bound Eu 3+. The supernatant was decanted and the fluorescence was determined in an "Arcus 1230" time-delayed fluorometer (LKB-Wallac, Turku, Finland). Excitation and emission were 340 and 613 nm, respectively. Delay and count times were both set to 400 μs (Fig. 3).

Claims

- 2. "2. -P a t e n t a n s p r ü c h e - 2. "2. -Patent claims
1. Teils einzel- und teils doppelsträngige Nuklein¬ säuresonde, die an ihrem doppeisträngigen Bereich kovalent gebunden eine quervernetzende Verbindung enthält, d a d u r c h g e k e n n z e i c h ¬ e t , daß über eine funktionelle Gruppe der quervernetzenden Verbindung ein Chelatbildner für Metallionen an die Nukleinsäuresonde gebunden ist.1. Partly single and partly double-stranded nucleic acid probe, which contains a cross-linking compound covalently bound to its double-stranded region, so that a chelating agent for metal ions is bound to the nucleic acid probe via a functional group of the cross-linking compound.
2. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 1, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß sie in ihrem einzelsträngigen Be¬ reich zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure kom¬ plementär ist.2. Nucleic acid probe according to claim 1, characterized in that it is complementary to a nucleic acid to be detected in its single-stranded region.
3. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 1, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß ihr' einzelsträngiger Bereich aus einer homopolymeren DNS besteht.3. Nucleic acid probe according to claim 1, characterized gekenn¬ characterized in that its ' single-stranded area consists of a homopolymeric DNA.
4. Nukleinsäuresonde nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die funktionelle. Gruppe eine Amino-, Thiol-, Hydroxy- oder Carboxygruppe ist.4. Nucleic acid probe according to one of claims 1-3, characterized in that the functional. Group is an amino, thiol, hydroxy or carboxy group.
5. Nukleinsäuresonde nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die quervernetzende Verbindung eine interkalierende Verbindung ist.5. Nucleic acid probe according to one of claims 1 to 3, characterized in that the cross-linking compound is an intercalating compound.
6. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 5, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die quervernetzende Verbindung ein Psoralen oder ein Phenanthridiumdiazid ist. 6. Nucleic acid probe according to claim 5, characterized gekenn¬ characterized in that the cross-linking compound is a psoralen or a phenanthridium diazide.
7. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 5, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die quervernetzende Verbindung Mitomycin C oder Carcinophilin A ist.7. Nucleic acid probe according to claim 5, characterized gekenn¬ characterized in that the cross-linking compound is mitomycin C or carcinophilin A.
8. Nukleinsäuresonde nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätz¬ lich zwischen der quervernetzenden Verbindung und dem Chelatbildner ein Linkermolekül enthält.8. Nucleic acid probe according to one of the preceding claims, characterized in that it additionally contains a linker molecule between the cross-linking compound and the chelating agent.
9. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 8, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß das Linkermolekül ein bifunktionel- les Vernetzungsreagens ist.9. Nucleic acid probe according to claim 8, characterized gekenn¬ characterized in that the linker molecule is a bifunctional cross-linking reagent.
10. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Linkermolekül ein hetero- bifunktionelles Vernetzungsreagens ist.10. Nucleic acid probe according to claim 8 or 9, characterized in that the linker molecule is a heterobifunctional cross-linking reagent.
11. Nukleinsäuresonde nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie zwi¬ schen der queryernetzenden Verbindung bzw. gegebe¬ nenfalls dem Linkermolekül und dem Chelatbildner zusätzlich ein makromolekulares Trägermolekül mit mindestens einer funktioneilen Amino- oder Thiol- gruppe enthält.11. Nucleic acid probe according to one of the preceding claims, characterized in that it additionally contains a macromolecular carrier molecule with at least one functional amino or thiol group between the query-wetting compound or, where appropriate, the linker molecule and the chelating agent.
12. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 11,dadurch gekenn¬ zeichnet, daß das. Trägermolekül mehrere funktionelle Gruppen enthält, an die mehrere Moleküle Chelat¬ bildner gebunden sind.12. Nucleic acid probe according to claim 11, characterized in that the carrier molecule contains several functional groups to which several molecules of chelating agents are bound.
13. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 12, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß das Trägermolekül ein homopoly- meres oder heteropolymeres Polypeptid ist.13. Nucleic acid probe according to claim 12, characterized in that the carrier molecule is a homopolymeric or heteropolymeric polypeptide.
14. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 13, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß das Trägermolekül Polylysin oder Polycystein ist. - 2 «f -14. Nucleic acid probe according to claim 13, characterized in that the carrier molecule is polylysine or polycysteine. - 2 «f -
15. Nukleinsäuresonde nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Chelat¬ bildner für Metallionen caDPTA, das gemischte An¬ hydrid von DTPA und Isobutylcarboxycarbonsäure,15. Nucleic acid probe according to one of the preceding claims, characterized in that the chelating agent for metal ions caDPTA, the mixed anhydride of DTPA and isobutylcarboxycarboxylic acid,
1-(p-Isothiocyanatophenyl)-DTPA, 1-(p-Isothio- cyanatophenyl)-EDTA, 1-(p-Diazophenyl)-EDTA oder ein Phenylazid-Derivat von DTPA oder EDTA ist.Is 1- (p-isothiocyanatophenyl) DTPA, 1- (p-isothiocyanatophenyl) EDTA, 1- (p-diazophenyl) EDTA or a phenylazide derivative of DTPA or EDTA.
16. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatbildner für Metall¬ ionen ein Kryptat ist. .16. Nucleic acid probe according to claim 1 to 14, characterized in that the chelating agent for metal ions is a cryptate. .
17. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 16, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß das Kryptat aus Oά,ö£ -Bipyridin- oder 1,10-Phenantrolin-Einheiten besteht.17. Nucleic acid probe according to claim 16, characterized ge indicates that the cryptate consists of Oά, ö £ -bipyridine or 1,10-phenantroline units.
18. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 16 oder 17, da¬ durch gekennzeichnet, daß das Kryptat bereits fluoreszente Metallionen enthält.18. Nucleic acid probe according to claim 16 or 17, characterized in that the cryptate already contains fluorescent metal ions.
19. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 18, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß die fluoreszenten Metallionen Ionen der seltenen Erden sind.19. Nucleic acid probe according to claim 18, characterized in that the fluorescent metal ions are rare earth ions.
20. Nukleinsäuresonde nach Anspruch 19, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß die fluoreszenten Metallionen20. Nucleic acid probe according to claim 19, characterized in that the fluorescent metal ions
Eu 3+, Tb3+ oder/und Sm3+ sind.Eu 3+, Rb3 + or / and Sm3 + are.
21. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1, 2 und 4 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man eine zu einer nachzuwei¬ senden Nukleinsäuresequenz komplementäre DNA-Se¬ quenz in ein doppeisträngiges Plasmid insertiert, mit einer Restriktionsendonuklease im Bereich des Inserts schneidet und dadurch das Plasmid lineari- siert, mit einer Exonuklease von beiden Enden her z ς -21. A method for producing a nucleic acid according to one of claims 1, 2 and 4 to 18, characterized in that a DNA sequence which is complementary to a nucleic acid sequence to be detected is inserted into a double-stranded plasmid with a restriction endonuclease in the region of the insert cuts and thereby linearizes the plasmid with an exonuclease from both ends z ς -
jeweils selektiv nur einen Strang des linearisier- ten Doppelstrangs im Bereich des Inserts abbaut, an den verbleibenden Doppelstrang eine querver¬ netzende Verbindung kovalent koppelt, die mindes¬ tens eine funktionelle Gruppe enthält, und an die funktioneilen Gruppen einen Chelatbildner bindet.selectively degrades only one strand of the linearized double strand in the region of the insert, covalently couples a cross-linking compound to the remaining double strand, which contains at least one functional group, and binds a chelating agent to the functional groups.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeich¬ net, daß man eine quervernetzende Verbindung ver¬ wendet, die als funktionelle Gruppe eine Amino-, Thiol-, Hydroxy- oder Carboxygruppe enthält.22. The method according to claim 21, characterized gekennzeich¬ net that one uses a cross-linking ver¬ containing an amino, thiol, hydroxyl or carboxy group as a functional group.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß man als quervernetzende Verbin¬ dung eine interkalierende Verbindung verwendet.23. The method according to claim 21 or 22, characterized ge indicates that an intercalating connection is used as the cross-linking connection.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeich¬ net, daß man ein Psoralen oder ein Phenantridium¬ diazid verwendet und die kovalente Bindung an die Nukleinsäuresonde durch Bestrahlung mit UV-Licht bewirkt.24. The method according to claim 23, characterized in that a psoralen or a phenantridium diazide is used and the covalent binding to the nucleic acid probe is effected by irradiation with UV light.
25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeich¬ net, daß man 'Mitomycin C oder Carcinophilin A verwendet und die kovalente Bindung an die Nukle¬ insäuresonde durch Ansäuern der Reaktionslösung bewirkt.25. The method according to claim 23, characterized gekennzeich¬ net that 'Mitomycin C or Carcinophilin A used and the covalent binding to the nucleic acid probe by acidifying the reaction solution.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, da¬ durch gekennzeichnet, daß man als Chelatbildner für Metallionen caDPTA, das gemischte Anhydrid von DTPA und Isobutylcarboxycarbonsäure, l-(p-Iso- thiocyanatophenyl)-DTPA,1-(p-Isothiocyanatophenyl)- EDTA, 1-(p-Diazophenyl)-EDTA, ein Phenylazid- Derivat von DTPA oder EDTA oder ein Kryptat ver¬ wendet. ' I - Z b -26. The method according to any one of claims 21 to 25, characterized in that caDPTA as the chelating agent for metal ions, the mixed anhydride of DTPA and isobutylcarboxycarboxylic acid, l- (p-isothiocyanatophenyl) -DTPA, 1- (p-isothiocyanatophenyl) ) - EDTA, 1- (p-diazophenyl) EDTA, a phenylazide derivative of DTPA or EDTA or a cryptate. ' I - Z b -
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeich¬ net, daß man ein Kryptat aus ~> , C-Bipyridin- oder 1,10-Phenantrolin-Einheiten einsetzt.27. The method according to claim 26, characterized gekennzeich¬ net that one uses a cryptate from ~ >, C-bipyridine or 1,10-phenantroline units.
28. Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß man ein- ryptat verwendet, welches bereits fluoreszente Me'tallionen der seltenen Erden enthält.28. The method according to claim 26 or 27, characterized in that one uses ryptate which already contains fluorescent metal ions of the rare earths.
29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeich- net, daß man Kryptate von Eu 3+, Tb3-- oder/und Sm3+ verwendet.29. The method according to claim 28, characterized in that cryptates of Eu 3+, Tb3-- or / and Sm3 + are used.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 29, da¬ durch gekennzeichnet, daß man zwischen die quer¬ vernetzende Verbindung und den Chelatbildner zu¬ sätzlich ein Linkermolekül einbringt.30. The method according to any one of claims 21 to 29, characterized in that a linker molecule is additionally introduced between the crosslinking compound and the chelating agent.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeich¬ net, daß man als Linkermolekül ein bifunktionelles Vernetzungsreagens verwendet.31. The method according to claim 30, characterized gekennzeich¬ net that a bifunctional crosslinking reagent is used as the linker molecule.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeich¬ net, daß man als Linkermolekül ein heterobifunk- tionelles Vernetzungsreagens verwendet.32. The method according to claim 31, characterized in that a heterobifunctional crosslinking reagent is used as the linker molecule.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 32, da¬ durch gekennzeichnet, daß man zwischen die quer¬ vernetzende Verbindung bzw. gegebenenfalls das Linkermolekül und den Chelatbildner zusätzlich ein makromolekulares Trägermolekül mit mindestens einer funktionellen A ino- oder Thiolgruppe ein¬ bringt.33. The method according to any one of claims 21 to 32, characterized in that one additionally introduces a macromolecular carrier molecule having at least one functional amino or thiol group between the cross-linking compound or, if appropriate, the linker molecule and the chelating agent.
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeich¬ net, daß man ein Trägermolekül verwendet, das meh¬ rere futiktionelie Gruppen enthält, und daran- meh¬ rere Chelatbildner bindet. 34. The method according to claim 33, characterized in that one uses a carrier molecule which contains several futiktionelie groups, and binds several chelating agents.
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeich¬ net, daß man als Trägermolekül ein homopoly eres oder heteropolymeres Polypeptid verwendet.35. The method according to claim 34, characterized in that a homopolymeric or heteropolymeric polypeptide is used as the carrier molecule.
36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeich¬ net, daß man Polylysin oder Polycystein verwendet.36. The method according to claim 35, characterized gekennzeich¬ net that one uses polylysine or polycysteine.
37. Verfahren zur Herstellung einer Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 2 und 4 bis 18, dadurch ge¬ kennzeichnet, daß man eine Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 mit einer Einzelstrang-DNS oder RNS, die die für die Nachweishybridisierung erforder¬ liche Sequenz und einen homopolymeren Einzelstrang, der zu derNukleinsäuresonde nach Anspruch 3 komple¬ mentär ist, enthält, hybridisiert.37. A method for producing a nucleic acid according to one of claims 2 and 4 to 18, characterized ge indicates that a nucleic acid probe according to claim 3 with a single-stranded DNA or RNA, which has the sequence required for detection hybridization and a homopolymeric single strand , which is complementary to the nucleic acid probe according to claim 3, contains hybridized.
38. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäuresonde unter Ausbildung eines Hybriddoppelstrangs, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man eine Nukleinsäuresonde nach einem der Ansprüche 1, 2 und 4 bis 15 verwendet, nach erfolg¬ ter Hybridisierung eine Lösung eines fluorogenen Metallions zugibt und nach Entfernen der Metall¬ ionenlösung und Waschen die gebundenen Metall¬ ionen durch eine Verstärkerlösung extrahiert und den gebildeten Hybriddoppelstrang über die Fluo¬ reszenz der Metallionen in der Verstärkerlösung nachweist.38. A method for the detection of nucleic acids by hybridization with a nucleic acid probe to form a hybrid double strand, characterized in that a nucleic acid probe according to one of claims 1, 2 and 4 to 15 is used, a solution of a fluorogenic metal ion is added after hybridization has taken place and after removal the metal ion solution and washing, the bound metal ions are extracted by an amplifier solution and the hybrid double strand formed is detected via the fluorescence of the metal ions in the amplifier solution.
39. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäuresonde unter Ausbildung eines Hybriddoppelstrangs, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 bis 15 verwendet, diese entweder zuerst mit einer Einzelstrang-DNS oder RNS, die - ~Z.$ -39. A method for the detection of nucleic acids by hybridization with a nucleic acid probe to form a hybrid double strand, characterized in that one uses a nucleic acid probe according to claim 3 to 15, either first with a single strand DNA or RNA, the - ~ Z. $ -
die zu einer nachzuweisenden Nukleinsäure komple¬ mentäre Sequenz und einen homopolymeren Nukleinsäure- schwanz, der mit dem homopolymeren Einzelstrang der Nukleinsäuresonde nach Anspruch 3 komplementär ist, enthält, und danach mit der nachzuweisenden Nukleinsäuresonde hybridisiert oder aber gleichzeitig mit der Einzelstrang-DNS oder der RNS und der nachzuweisenden Nukleinsäuresonde hybridisiert, nach erfolgter Hybridisierung eine Lösung eines fluorogenen Metallions zugibt und nach Entfernen der Metall- ionenlösung und Waschen die gebundenen Metall- ionen durch eine Verstärker¬ lösung extrahiert und den gebildeten Hybriddoppel¬ strang über die Fluo- reszenz der Metallionen in der Verstärkerlösung nachweist.contains the sequence complementary to a nucleic acid to be detected and a homopolymeric nucleic acid tail which is complementary with the homopolymeric single strand of the nucleic acid probe according to claim 3, and thereafter hybridizes with the nucleic acid probe to be detected or simultaneously with the single stranded DNA or the RNA and hybridizes the nucleic acid probe to be detected, adds a solution of a fluorogenic metal ion after hybridization has taken place, and after removing the metal ion solution and washing the bound metal ions are extracted by an amplifying solution and the hybrid double strand formed is fluorescent of the metal ions in the amplifying solution proves.
40. Verfahren nach Anspruch 38 oder 39, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß man als fluorogene Metallionen Ionen der seltenen Erden verwendet.40. The method according to claim 38 or 39, characterized gekenn¬ characterized in that one uses rare earth ions as fluorogenic metal ions.
41. Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeich- net, daß man Eu 3+, Tb3+ oder Sm3+ verwendet.41. The method according to claim 40, characterized in that one uses Eu 3+, Tb3 + or Sm3 +.
42. Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren durch Hybridisierung mit einer Nukleinsäure unter Aus¬ bildung eines Hybriddoppelstrangs, d a d u r c g e k e n n z e i c h n e t , daß man eine Nu¬ kleinsäuresonde nach den Ansprüchen 16 bis 18 ver¬ wendet und die Fluoreszenz der Metallionen direkt am Hybriddoppelstrang bestimmt. 42. A method for the detection of nucleic acids by hybridization with a nucleic acid to form a hybrid double strand, characterized in that a nucleic acid probe according to claims 16 to 18 is used and the fluorescence of the metal ions is determined directly on the hybrid double strand.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 38 bis 42, da¬ durch gekennzeichnet, daß man die Hybridisierung mit einer auf einem Träger gebundenen nachzuweisen¬ den Nukleinsäure durchführt. 43. The method according to any one of claims 38 to 42, characterized in that the hybridization is carried out with a nucleic acid to be detected bound on a support.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0822261A1 (en) * 1996-07-29 1998-02-04 Academia Sinica Methods for rapid antimicrobial susceptibility testing

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5399719A (en) 1993-06-28 1995-03-21 Steritech, Inc. Compounds for the photodecontamination of pathogens in blood
AU5779399A (en) 1998-08-21 2000-03-27 Naxcor Assays using crosslinkable immobilized nucleic acids
US6303799B1 (en) 1998-11-10 2001-10-16 Naxcor Polynucleotide crosslinking agents

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0131830A1 (en) * 1983-07-14 1985-01-23 Molecular Diagnostics, Inc. Labelled nucleic acid probes and adducts for their preparation
EP0156287A2 (en) * 1984-03-21 1985-10-02 Cetus Corporation Process for labeling nucleic acids using psoralen derivatives
EP0212951A2 (en) * 1985-08-15 1987-03-04 Amoco Corporation Labelled nucleic acids
WO1987002708A1 (en) * 1985-10-24 1987-05-07 Siska Diagnostics, Inc. Lanthanide chelate-tagged nucleic acid probes
WO1987003622A1 (en) * 1985-12-13 1987-06-18 Princeton University Amplified hybridization assay
EP0235726A2 (en) * 1986-03-05 1987-09-09 Miles Inc. Rapid detection of nucleic acid sequences in a sample by labeling the sample
EP0237833A2 (en) * 1986-03-05 1987-09-23 Miles Inc. Solution-phase hybridization assay for detecting polynucleotide sequences

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0131830A1 (en) * 1983-07-14 1985-01-23 Molecular Diagnostics, Inc. Labelled nucleic acid probes and adducts for their preparation
EP0156287A2 (en) * 1984-03-21 1985-10-02 Cetus Corporation Process for labeling nucleic acids using psoralen derivatives
EP0212951A2 (en) * 1985-08-15 1987-03-04 Amoco Corporation Labelled nucleic acids
WO1987002708A1 (en) * 1985-10-24 1987-05-07 Siska Diagnostics, Inc. Lanthanide chelate-tagged nucleic acid probes
WO1987003622A1 (en) * 1985-12-13 1987-06-18 Princeton University Amplified hybridization assay
EP0235726A2 (en) * 1986-03-05 1987-09-09 Miles Inc. Rapid detection of nucleic acid sequences in a sample by labeling the sample
EP0237833A2 (en) * 1986-03-05 1987-09-23 Miles Inc. Solution-phase hybridization assay for detecting polynucleotide sequences

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nucleic Acids Research, Band 16, Nr. 3, 11. Februar 1988, IRL Press Ltd, (Oxford, GB), A. Oser et al.: "Sensitive non-radioactive dot-blot hybridization using DNA probes labelled with chelate group substituted psoralen and quantitative detection by europium ion fluorescence", Seiten 1181-1196 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0822261A1 (en) * 1996-07-29 1998-02-04 Academia Sinica Methods for rapid antimicrobial susceptibility testing
US5789173A (en) * 1996-07-29 1998-08-04 Academia Sinica Methods for rapid antimicrobial susceptibility testing

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