DE69233468T3 - Prüfung und modell für alzheimers-krankheit - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Alzheimer-Krankheit ist eine fortschreitende Krankheit, die allgemein als senile Demenz bekannt ist. Allgemein fällt diese Krankheit in zwei Kategorien, nämlich später Beginn und früher Beginn. Der späte Beginn, der im hohen Alter einsetzt (65 und mehr Jahre) kann durch die natürliche Atrophie des Gehirns verursacht werden, die mit einer höheren Geschwindigkeit und mit einer schwereren Ausprägung als normal auftritt. Der frühe Beginn der Alzheimer-Krankheit ist wesentlich seltener, zeigt aber eine pathologisch identische Demenz mit diffuser Hirnatrophie, die sich weit vor der senilen Periode entwickelt, d. h. im Alter zwischen 35 und 60 Jahren. Es gibt Hinweise, dass eine Form dieses Typs von Alzheimer-Krankheit sich bevorzugt in Familien entwickelt, und ist daher als familiäre Alzheimer-Krankheit (FAD) bekannt.
  • Bei beiden Arten der Alzheimer-Krankheit ist die Pathologie dieselbe, aber die Anomalien treten schwerer und stärker verbreitet in Fällen auf, die in einem jüngeren Alter beginnen. Die Krankheit wird durch zwei Arten von Läsionen im Gehirn gekennzeichnet, das sind senile Plaques und neurofibrilläre Knäuel.
  • Senile Plaques sind Bereiche von desorganisiertem Neuropil von bis zu 150 μm im Durchmesser mit extrazellulären Amyloidablagerungen in der Mitte. Neurofibrilläre Knäuel sind intrazelluläre Ablagerungen von Amyloidprotein, die aus zwei paarweise miteinander verdrillten Fäden bestehen.
  • Die Hauptprotein-Untereinheit, β-Amyloidprotein, der Amyloidfäden der senilen Plaque ist ein stark aggregierendes kleines Polypeptid mit einem ungefähren relativen Molekulargewicht von 4.500. Dieses Protein ist ein Spaltprodukt eines viel größeren Vorläuferproteins, das Amyloid-Vorläuferprotein (APP) genannt wird.
  • Zur Zeit gibt es keine bekannte wirksame Therapie für die verschiedenen Formen der Alzheimer-Krankheit (AD). Es gibt jedoch mehrere andere Formen von Demenz, für die eine Therapie verfügbar ist und die zu einer fortschreitenden Verschlechterung des geistigen Zustandes führen, welche der mit der Alzheimer-Krankheit verbundenen Demenz sehr ähnelt. Ein diagnostischer Test für die Alzheimer-Krankheit wäre daher ein wertvolles Werkzeug bei der Diagnose und Behandlung dieser anderen Zustände, um auf diesem Wege die Alzheimer-Krankheit auszuschließen. Er ist auch von Wert, wenn eine geeignete Therapie dann doch einmal zur Verfügung steht.
  • Ebenfalls wichtig ist die Entwicklung experimenteller Modelle der Alzheimer-Krankheit, die dazu verwendet werden können, die an der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit beteiligten zu Grunde liegenden biochemischen Ereignisse weiter zu bestimmen. Solche Modelle würden vermutlich bei einer Anwendung dazu verwendet werden, nach Substanzen zu suchen, die den degenerativen Verlauf der Alzheimer-Krankheit verändern. Zum Beispiel könnte ein Modellsystem der Alzheimer-Krankheit dazu verwendet werden, nach Umweltfaktoren zu suchen, die die Pathogenese der Alzheimer-Krankheit in Gang setzen oder beschleunigen. Im Gegensatz dazu könnte ein experimentelles Modell dazu verwendet werden, nach Substanzen zu suchen, die den Fortgang der Alzheimer-Krankheit hemmen, verhindern oder umkehren. Vermutlich könnten solche Modelle zur Entwicklung von Pharmazeutika eingesetzt werden, die bei der Verhütung, Hemmung oder Umkehrung der Alzheimer-Krankheit wirksam sind.
  • ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • In einem ersten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz, die humanes Mutantenamyloid-Vorläuferprotein(APP)-Allel codiert, welches mit einer genetischen Prädisposition für die früh ausbrechende Alzheimer-Krankheit konsegregiert, wobei das Mutanten-APP-Allel eine Aminosäurensubstitution an der Position besitzt, die durch das Codon 717 wie in Bezug auf APP770 definiert codiert wird.
  • In einem zweiten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung mit einer Polynukleotidsonde, die in der Lage ist, spezifisch an ein Amyloid-Vorläuferprotein 770 (APP770)-Allel zu hybridisieren, das eine Mutation an Codon 717 aufweist, so dass auf einem Southern-Blot eine Bande, welche dem APP770 entspricht, identifiziert werden kann, wohingegen ein entsprechendes Wildtypallel nicht identifiziert werden kann oder auf Grund der Signalintensität von dem APP770-Allel unterschieden werden kann.
  • In einem dritten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung einen transgenen Wirt, der ein rekombinantes Polynukleotid einschließlich einer Nukleinsäuresequenz aufweist, welche ein humanes Mutantenamyloid-Vorläuferprotein(APP)-Allel codiert, das mit einer genetischen Prädisposition für früh ausbrechende Alzheimer-Krankheit konsegregiert, wobei der Wirt nicht ein Mensch ist und wobei das Mutanten-APP-Allel eine Aminosäurensubstitution an der Position besitzt, die durch das Codon 717 wie in Bezug auf APP770 definiert codiert wird, und wobei der Wirt, wenn er ein Tier ist, eine Maus ist.
  • Gemäß Standardprotokollen können kultivierte humane Zellen, entweder primäre Kulturen oder immortalisierte Zelllinien, mit einem Mutanten-APP-Allel transfiziert werden, entweder vorübergehend oder stabil, so dass die kultivierte humane Zelle ein Mutanten-APP-Polypeptid exprimiert. Die Zellen sind im typischen Fall Säugetierzellen und vorzugsweise Säugetierzellen aus der Linie von neuralen, glialen oder astrozytischen Zellen.
  • In einem vierten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung eine Methode zur Suche nach einem Mittel, das die früh ausbrechende Alzheimer-Krankheit behandeln kann und folgendes umfasst:
    Das In-Kontakt-bringen eines Wirtes der dritten Erscheinungsform mit dem Agens; und
    Überwachen der Expression oder Verarbeitung von Proteinen, die durch das Mutantenallel codiert werden.
  • In einem fünften Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer transgenen Maus bereit, die ein Mutanten-APP-Gen als Modell für die früh ausbrechende Alzheimer-Krankheit enthält, wobei das Mutanten-APP-Gen ein Mutanten-717-Codon besitzt.
  • In einem sechsten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung eine kultivierte humane primäre oder immortalisierte Zelle mit einer Nukleinsäuresequenz, die eine Mutante von Position 717 des humanen Amyloid-Vorläuferproteins 770 (APP770) oder eine APP-Isoform, welches die Mutation aufweist.
  • In einem siebenten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine diagnostische Methode zur Bestimmung einer ererbten Prädisposition für die früh ausbrechende Alzheimer-Krankheit in einer Versuchsperson bereit, die das Feststellen des Vorhandenseins eines Allels des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) in der Versuchsperson umfasst, wobei das vorerwähnte Allel einen Sequenz-Polymorphismus an einer Position aufweist, die dem Codon 717 von APP770 entspricht, wobei der Schritt der Feststellung an Material ausgeführt wird, das dem Körper der Versuchsperson entnommen und nicht wieder in diesen zurückgeführt wird.
  • In einem achten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Methode zur Genanalyse einer menschlichen Versuchsperson bereit, die das Feststellen des Vorhandenseins oder Fehlens von mindestens einem Polymorphismus an Codon 717 eines APP770-Gens eines Amyloid-Vorläuferprotein(APP)-Gens in der Versuchsperson enthält, wobei der Schritt des Feststellens an Material ausgeführt wird, das dem Körper der Versuchsperson entnommen und nicht wieder in diesen zurückgeführt wird. Es werden also Methoden zur Lokalisierung des Vorliegens von genetischen Veränderungen bereitgestellt, die mit der Alzheimer-Krankheit verbunden sind. Diese diagnostischen Methoden können zur Vorhersage der Krankheitsentwicklung vor dem Ausbruch, für das genetische Screening oder zur Feststellung einer speziellen Mutation in einem experimentellen nichthumanen Tier oder einer Zelle verwendet werden.
  • In einem neunten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die ein von menschlichen Proteinen freies Polypeptid enthält, welche eine Kernsequenz umfasst:
    Ile-Ala-Thr-Val-Ile-X-Ile-Thr-Leu [SEQ ID NO:6]
    wobei X eine der zwanzig herkömmlichen Aminosäuren außer Valin ist.
  • Bevorzugte Merkmale der Erfindung werden hierin in den angeschlossenen Ansprüchen beschrieben.
  • In einem zehnten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Feststellung des Vorhandenseins des Gens für die früh ausbrechende Alzheimer-Krankheit in einer Nukleinsäure oder einer anderen, der Versuchsperson entnommenen Probe bereit, die die Identifizierung einer genetischen Veränderung in einer Gensequenz umfasst, welche für APP codiert, wobei die genetische Veränderung eine Mutation am Codon 717 darstellt. Solche genetischen Veränderungen können Mutationen, Einfügungen oder Verluste von Genabschnitten einschließen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
  • 1 illustriert einen ersten Stammbaum, bei dem die früh ausbrechende Alzheimer-Krankheit offensichtlich als autosomale dominante Störung ererbt wird. Das durchschnittliche Alter beim Ausbruch in dieser Familie beträgt 57±5 Jahre. Schwarze Symbole bezeichnen betroffene Individuen, und schräge Linien zeigen Individuen an, die verstorben sind. Frauen werden durch Kreise und Männer durch Quadrate bezeichnet. Dreiecke werden in der Top-Reserve-Anonymität der gegenwärtigen Generation verwendet. In der Generation II waren die Ehepartner der zwei betroffenen Brüder Schwestern. Proben standen von 13 Individuen, deren Haplotypen dargestellt sind, von weiteren 19 Kindern und Ehegatten dieser Individuen und von 7 weiter entfernt verwandten, nicht betroffenen Individuen zur Verfügung. Unterhalb des Stammbaums befinden sich die Ideogramme der zwei Chromosomen 21 in jedem Individuum der dritten Generation an vier Genorten auf dem langen Arm des Chromosoms. Die Kopplungsdaten weisen daraufhin, dass die schwarzen Chromosomen von den betroffenen Vätern ererbt wurden.
  • 2 zeigt ein Autoradiogramm eines Sequenzierungsgels aus einem Teil von Exon 17 des APP-Gens in einem normalen und einem betroffenen Individuum aus dem Stammbaum von 1, das eine einzelne Basenpaaränderung beim Basenpaar 2149 in der betroffenen Person zeigt. Dieser C zu T-Übergang führt zu einer Aminosäurensubstitution eines Valins durch ein Isoleucin bei Codon 717.
  • 3 zeigt einen Teil der Aminosäurensequenz, die von den Exons 16 und 17 des APP-Gens codiert wird; er zeigt die Mutation von Valin zu Isoleucin (V zu I) innerhalb der transmembranen Domäne und die Mutation, die HCHWA-D (E zu Q) in der extrazellulären Domäne verursacht. Der schattierte Bereich der transmembranen Domäne und die eingeschlossenen Aminosäuren der extrazellulären Domäne stellen die Sequenz des abgelagerten β-Amyloidpeptids dar. Basierend auf Kang et al. (1987) Nature 325:733.
  • 4 zeigt BclI-Bruchstücke des Exon 17-PCR-Produktes von nicht betroffenen und betroffenen Individuen bei der früh ausbrechenden Alzheimer-Krankheit, die die Kosegregation des Restriktionsortes und der Krankheit zeigen.
  • 5 zeigt den Stammbaum von Familie F19 zusammen mit D21S210-Daten.
  • 6 zeigt APP-Exon 17-Sequenzen bei einem nicht betroffenen und einem betroffenen Mitglied von F19. Bei dem betroffenen Individuum besteht ein G zu T-Übergang an Position 2150.
  • 7 zeigt die Sequenz von APP695.
  • 8 zeigt die Sequenz von APP751.
  • 9 zeigt die Sequenz von APP770.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
  • Die Ansammlung von β-Amyloidprotein (A4) in bestimmten Hirngebieten ist eines der pathologischen Hauptmerkmale der Alzheimer-Krankheit. Das β-Amyloidprotein ist ein Protein von etwa 4 kD (39 bis 42 Aminosäuren), das als internes Spaltungsprodukt aus einer oder mehreren Isoformen eines größeren Amyloid-Vorläuferproteins (APP) abgeleitet ist. Es gibt mindestens fünf unterschiedliche Isoformen von APP, die 563, 695, 714, 751 bzw. 770 Aminosäuren enthalten (Wirak et al. (1991) Science 253:323). Diese Isoformen von APP werden durch alternatives Spleissen von primären Transkripten eines einzigen Gens erzeugt, das als APP-Gen bezeichnet wird, welches sich auf dem menschlichen Chromosom 21 befindet. Es ist bekannt, dass die meisten APP-Isoformen glycosylierte Transmembranproteine sind (Goldgraber et al. (1987) Science 235:877) und dass vier von den Isoformen (AA563, APP714, APP751 und APP770) eine Proteaseinhibitor-Domäne besitzen, die homolog zum Kunitz-Typ der Serin-Proteaseinhibitoren sind. Das β-Amyloid(A4)-Segment umfasst etwa die Hälfte der Transmembrandomäne und annähernd die ersten 28 Aminosäuren der extrazellulären Domäne einer APP-Isoform.
  • Die proteolytische Verarbeitung von APP in vivo ist ein normaler physiologischer Prozess. Die am Carboxy-Terminus beschnittenen Formen von APP695, APP751 und APP770 sind im Gehirn und in der cerebrospinalen Flüssigkeit vorhanden (Palmert et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 86:6338; Weidemann et al. (1989) Cell 57:115) und resultieren aus der Spaltung der APP-Isoform an einem konstitutiven Spaltungsort innerhalb der A4-Peptid-Domäne einer APP-Isoform (Esch et al. (1990) Science 248:1122). Die normale proteolytische Spaltung am konstitutiven Spaltungsort ergibt ein (annähernd 100 kD) großes, lösliches, N-terminales Fragment, das die Proteaseinhibitor-Domäne in einigen Isoformen enthält, und ein 9–10 kD großes, membrangebundenes, C-terminales Fragment, das den größten Teil der A4-Domäne enthält.
  • Die Erzeugung des pathogenen β-Amyloid(A4)-Proteins scheint das Ergebnis der abweichenden oder alternativen proteolytischen Verarbeitung von APP zu sein, so dass die normale Spaltung am konstitutiven Ort innerhalb der A4-Domäne nicht auftritt, sondern dass vielmehr eine Spaltung an zwei speziellen Orten auftritt, die die A4-Domäne flankieren. Einer dieser abweichenden Spaltungsorte liegt in der Transmembrandomäne, und der andere abweichende Spaltungsort liegt ungefähr beim N-Terminus der ersten 28 Aminosäuren der extrazellulären Domäne (siehe 3). Eine solche abweichende proteolytische Spaltung erzeugt β-Amyloid A4-Polypeptid, das zur Bildung dichter, Amyloid erzeugender Aggregate neigt, die gegen proteolytischen Abbau und Beseitigung beständig sind. Die resultierenden β-Amyloidaggregate sind vermutlich an der Bildung von häufig vorkommenden Amyloid-Plaques und zerebrovaskulärem Amyloid beteiligt, die die neuropathologischen Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit sind. Jedoch sind die exakten abweichenden Spaltungsorte nicht immer präzise; aus dem Gehirn eines Patienten mit Alzheimer-Krankheit isolierte β-Amyloidmoleküle zeigen N- und C-terminale Heterogenität. Daher kann der abweichende Spaltungsweg entweder sequenzspezifische Proteolyse beinhalten, gefolgt von Exopeptidase-Aktivität (die End-Heterogenität erzeugt), oder ist eventuell nicht sequenzspezifisch.
  • Vom APP-Gen ist bekannt, dass es sich auf dem menschlichen Chromosom 21 befindet. Ein Genort, der mit der familiären Alzheimer-Krankheit segregiert, wurde auf dem Chromosom 21 (Hyslop et al. (1987) Science 235:885) dicht beim APP-Gen kartiert. Es wurde vorher über Rekombinante zwischen dem APP-Gen und dem Genort der Alzheimer-Krankheit berichtet (Schellenberg et al. (1988) Science 241:1507). Die Daten schienen das APP-Gen als den Ort jeglicher Mutation, die FAD verursachen könnte, auszuschließen (Van Broekhoven et al. (1987) Nature 329:153; Tanzi et al. (1987) Nature 329:156).
  • Rekombinante DNA-Technik stellt mehrere Verfahren zur Analyse von Genen bereit, um mögliche Mutationen zu lokalisieren. Zum Beispiel kann die Polymerase-Kettenreaktion (Bell (1989) Immunology Today, 10:351) dazu verwendet werden, spezielle Sequenzen mittels intronischer Primer zu verstärken, die dann durch direktes Sequenzieren analysiert werden können.
  • Forscher, die auf dem Gebiet der erblichen Hirnblutung mit Amyloidose vom holländischen Typ („HCHWA-D”) (Levy et al. (1990) Science 248:11224) arbeiten, fanden eine Ersetzung von Glu durch Gln am Rest 618 (bei Verwendung des APP695-Nummerierungssystems) in APP, wobei man annimmt, dass dies zur Ablagerung von β-Amyloid in den zerebralen Gefäßen dieser Patienten führt. Die vorliegenden Erfinder haben eine einzelne Basensubstitution identifiziert; ein C zu T-Übergang am Basenpaar 2149 wurde in einem Teil der Sequenz des APP-Gens in einigen Fällen von familiärer Alzheimer-Krankheit gefunden. Dieser Basenpaarübergang führt zu einer Aminosäurensubstitution, d. h. Valin zu Isoleucin bei Aminosäure 717 (APP770) (siehe Yoshikai et al. (1990) Gene 87:257), dicht beim C-Terminus des β-Amyloidproteins. Dies weist darauf hin, dass einige Fälle von Alzheimer-Krankheit durch Mutationen im APP-Gen und speziell Mutationen verursacht werden, die Codon 717 so ändern, dass es eine andere Aminosäure als Valin codiert.
  • Außerdem wurde in anderen Fällen von familiärer Alzheimer-Krankheit eine weitere Einzelbasensubstitution, ein T zu G-Übergang am benachbarten Basenpaar 2150, in einem Teil der Sequenz des APP-Gens gefunden. Dieser Basenpaarübergang führt zu einer anderen Aminosäurensubstitution, nämlich Valin zu Glycin bei Aminosäure 717, wodurch das Argument gestärkt wird, dass einige Fälle von Alzheimer-Krankheit durch Mutationen im APP-Gen, speziell an Codon 717, verursacht werden.
  • Es ist jetzt klar, dass eine Mutation im APP-Genort, die zu einem Auswechseln von Valin durch Isoleucin am Codon 717 (Rest 642 in APP695) führt, die Alzheimer-Krankheit in einigen Familien hervorruft (Goate et al. (1991) Nature 349:704). Eine zweite APP-Allelvariante, bei der Glycin für Valin am Codon 717 eingewechselt wird, ist jetzt identifiziert und ist so eng mit dem AD-Phänotyp verbunden, dass damit angezeigt wird, dass Allelenvarianten am Codon 717 der APP-Gens, besonders diejenigen, die eine andere Aminosäure als Valin codieren, und besonders diejenigen, die Isoleucin, Glycin oder Phenylalanin codieren, pathogene und/oder pathognomonische Allelen sind (Chartier-Harlin et al. (1991) Nature 353:844).
  • Die Proteolyse auf jeder Seite der β-Amyloid(A4)-Region von APP kann durch spezifische Mutationen an Codon 717 verstärkt oder qualitativ verändert werden, was die Rate der β-Amyloidablagerung und -Aggregation erhöht. Solche Codon 717-Mutationen können die Bildung von β-Amyloid dadurch erhöhen, dass sie ein schlechteres Substrat für den proteolytischen Hauptweg (Spaltung am konstitutiven Ort) oder ein besseres Substrat für einen konkurrierenden alternativen Spaltungsweg (an abweichenden Spaltungsorten) bereitstellen.
  • DEFINITIONEN
  • Eine Reihe von Begriffen und Ausdrücken werden in der ganzen Patentschrift verwendet; zum leichteren Verständnis derselben werden die folgenden Definitionen angeführt: Wie hier verwendet, bezieht sich „Exon” auf ein beliebiges Segment eines unterbrochenen Gens, das im reifen RNA-Produkt dargestellt wird.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich „Intron” auf ein Segment eines unterbrochenen Gens, das nicht im reifen RNA-Produkt dargestellt wird. Introns sind Teil des primären Kerntranskripts, werden aber ausgespleißt, um RNA herzustellen, die dann ins Zytoplasma transportiert wird.
  • Wie hier verwendet, kann der Ausdruck „Gensequenzcodierung für Amyloidproteinvorläufer” so interpretiert werden, dass er die DNA- und cDNA-Sequenz, wie von Yoshikai et al. (1990) Gene 87:257 und Kang et al., a. a. O., detailliert angeführt, zusammen mit der Promotor-DNA-Sequenz, wie von Salbaum et al., (1988) EMBO 7(9):2807 beschrieben, bedeutet.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Marker” oder „markiert” auf den Einbau eines nachweisbaren Markers (z. B. durch Einbau eines radiomarkierten Nukleotids oder durch Endmarkierung mit einem end-radiomarkierten Phosphat). DNA oder RNA wird im typischen Fall durch Einbau eines radiomarkierten Nukleotids (H3, C14, S35, P32) oder eines biotinylierten Nukleotids, das durch markiertes Avidin (zum Beispie Avidin, das einen Fluoreszenzmarker oder enzymatische Aktivität enthält), oder ein digoxygeninyliertes Nukleotid markiert, das durch markierte spezifische Antikörper festgestellt werden kann.
  • Wie hier verwendet, beziehen sich „Isoform”, „APP” und APP-Isoform” auf ein Polypeptid, das von mindestens einem Exon des APP-Gens codiert wird (Kitaguchi, et al., (1988) Nature 331:530; Ponte et al., ibid., S. 525; R. E. Tanzi, ibid., S. 528; de Sauvage and Octave (1989) Science 245:651; Golde et al. (1990) Neuron 4:253). Eine APP-Isoform kann von einem APP-Allel (oder einem Exon desselben) codiert werden, das mit einer Form der Alzheimer-Krankheit verbunden ist oder das nicht mit einem Phänotyp der Alzheimer-Krankheit verbunden ist.
  • Der Begriff „β-Amyloidgen” wird hier als Synonym für das APP-Gen verwendet, da β-Amyloid ein Proteinprodukt ist, das durch post-translationale Spaltung eines APP-Genproduktes erzeugt wird.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich „Fragment” auf ein Polypeptid von mindestens 9, im typischen Fall 50 bis 75 oder mehr Aminosäuren, wobei das Polypeptid eine Aminosäurekernsequenz enthält (die in der Reihenfolge vom N- zum C-Terminus aufgeführt wird):
    -Ile-Ala-Thr-Val-Ile-X-Ile-Thr-Leu- [SEQ ID NO:6]
    Dabei ist X eine der zwanzig herkömmlichen Aminosäuren außer Valin, und insbesondere ist X Isoleucin, Glycin oder Phenylalanin. Ein Fragment kann eine abgeschnittene APP-Isoform, (durch Aminosäurensubstitutionen, Deletionen oder Hinzufügungen außerhalb der Kernsequenz) modifizierte APP-Isoform oder andere abweichende Polypeptidsequenz sein, ist aber keine natürlich vorkommende APP-Isoform oder kein β-Amyloid-Polypeptid, das in einem menschlichen Individuum vorhanden ist, sei es mit der Alzheimer-Krankheit behaftet oder nicht. Wenn gewünscht, kann das Fragment an einem der beiden Termini mit zusätzlichen Aminosäuren verschmolzen werden, deren Zahl 1 bis 20, im typischen Fall 50 bis 100, aber auch bis zu 250, 500 oder mehr betragen kann.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich „APP751” bzw. „APP770” auf die 751 und 770 Aminosäurenreste langen Polypeptide, die vom menschlichen APP-Gen codiert werden (Ponte et al., a. a. O.; Kitaguchi et al., a. a. O.; Tanzi et al.).
  • Wie hier verwendet, bezieht sich „Codon 717” auf das Codon (d. h. die Trinukleotidsequenz), die die 717. Aminosäurenposition in APP770 oder die Aminosäurenposition in einer APP-Isoform oder das Fragment codiert, das der 717. Position in APP770 entspricht. Zum Beispiel (das keine Einschränkung darstellt) entspricht bei einem 670 Reste langen Fragment, das durch Beschneiden von APP770 durch Entfernen der 100 N-terminalen Aminosäuren erzeugt wird, die 617. Aminosäurenposition dem Codon 717. Tatsächlich bezieht sich Codon 717, wie verwendet, auf das Codon, das den 698. Aminosäurenrest von APP751 [SEQ ID NO:2] und den 642. Aminosäurenrest von APP695 [SEQ ID NO:1] codiert.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich „menschliche APP-Isoform oder Fragment” auf eine APP-Isoform oder ein Fragment, das eine Sequenz von mindestens 9 aufeinander folgenden Aminosäuren enthält, die identisch mit einer Sequenz in einem menschlichen APP770-, APP751- oder APP695-Protein ist, das in einem menschlichen Individuum natürlicherweise vorkommt und wobei eine identische Sequenz nicht in einem APP-Protein vorkommt, das natürlicherweise in nicht-menschlichen Arten auftritt.
  • Eine Nukleinsäure ist „wirkungsmäßig verbunden”, wenn sie in eine funktionale Beziehung zu einer anderen Nukleinsäuresequenz platziert wird. Zum Beispiel wird ein Promotor oder Verstärker wirkungsmäßig mit einer codierenden Sequenz verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst. Im Hinblick auf Transkription regulierende Sequenzen, bedeutet wirkungsmäßig verbunden, dass die verbundenen DNA-Sequenzen benachbart, und, wo es notwendig ist, zwei Protein codierende Bereiche zu verbinden, benachbart und im Translationsraster sind.
  • Der Begriff „entspricht” soll entsprechend dem hier verwendeten Gebrauch bedeuten, dass eine Sequenz homolog (d. h. identisch, nicht streng evolutionär verwandt) zu einer ganzen oder einem Teil einer Referenzsequenz ist. Im Gegensatz dazu soll der hier verwendete Begriff „komplementär zu” bedeuten, dass die komplementäre Sequenz homolog zu einer ganzen oder einem Teil einer Referenzsequenz ist. Zur Erläuterung entspricht die Nukleotidsequenz „TATAC” einer Bezugssequenz „TATAC” und ist komplementär zu einer Bezugssequenz „GTATA”.
  • Der hier verwendete Begriff „Transkriptionsverstärkung” soll sich auf die funktionale Eigenschaft beziehen, einen Anstieg in der Transkriptionsrate von verbundenen Sequenzen hervorzurufen, die einen funktionalen Promotor enthalten.
  • Der Begriff „Mittel” soll im hier verwendeten Gebrauch eine chemische Verbindung, eine Mischung chemischer Verbindungen, ein biologisches Makromolekül oder einen Extrakt bezeichnen, der aus biologischen Materialien hergestellt wird, wie z. B. Bakterien, Pflanzen, Pilze oder tierische (besonders Säugetier-)Zellen oder Gewebe. Mittel werden nach potenzieller biologischer Aktivität durch Aufnahme in unten beschriebene Screening-Tests beurteilt.
  • Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Mutante” auf APP-Allele mit Fehlsinnmutationen, die pathognomonisch für eine genetische Prädisposition für das Entwickeln einer Alzheimer-Krankheit sind; speziell eine Mutation an Codon 717 (wie durch die Aminosäurensequenz an APP770 angeführt) des APP-Gens, derart dass Codon 717 eine der neunzehn Aminosäuren codiert, die kein Valin sind (d. h. Glycin, Methionin, Alanin, Serin, Isoleucin, Leucin, Threonin, Prolin, Histidin, Cystein, Tyrosin, Phenylalanin, Glutaminsäure, Tryptophan, Arginin, Asparaginsäure, Asparagin, Lysin und Glutamin), vorzugsweise aber Isoleucin, Glycin oder Phenylalanin. Daher ist ein Mutanten-APP770-Polypeptid ein APP770-Polypeptid, das einen Aminosäurerest, der kein Valin ist, an Position 717 besitzt. Andere Mutanten-APP-Isoformen enthalten eine Aminosäure (nicht Valin) an einer Aminosäurerestposition, die dem Codon 717 entspricht (d. h. die von Codon 717 codiert wird). In ähnlicher Weise ist ein Mutanten-APP-Allel oder ein abweichendes APP-Codon 717 ein APP-Allel, das eine Aminosäure (nicht Valin) an Codon 717 codiert (bezogen auf die menschliche von APP770 abgeleitete Translation, wie in der Definition zu „Codon 717” , oben, beschrieben), vorzugsweise Isoleucin, Glycin oder Phenylalanin. Daher ist ein APP-Allel, das Valin an Codon 717 codiert, ein „Wildtyp”-APP-Allel.
  • Für den Fachmann auf diesem Gebiet ist ersichtlich, dass Nukleotidsubstitutionen, Deletionen und Hinzufügungen in die Polynukleotide der Erfindung einbezogen werden können. Jedoch sollten solche Nukleotidsubstitutionen, Deletionen und Hinzufügungen die Fähigkeit der Polynukleotide nicht wesentlich beeinträchtigen, sich an eine der in 5 und 6 gezeigten Polynukleotidsequenzen unter Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren, die ausreichend stringent sind, um zu einer spezifischen Hybridisation zu gelangen.
  • „Spezifische Hybridisation” wird hierin als die Bildung von Hybriden zwischen einem Sonden-Polynukleotid (z. B. einem Polynukleotid der Erfindung, das Substitutionen, Deletionen und/oder Hinzufügungen einschließen kann) und einem spezifischen Ziel-Polynukleotid (z. B. ein Polynukleotid mit einer Sequenz) definiert, wobei die Sonde vorzugsweise an ein spezifisches Target hybridisiert, derart dass zum Beispiel eine Bande, die einem abweichenden APP-Allel oder einem Restriktionsfragment desselben entspricht, in einem Southern-Blot identifiziert werden kann, während ein entsprechendes Wildtyp-APP-Allel (d. h. eins, das Valin an Codon 717 codiert) nicht identifiziert oder aus einem abweichenden APP-Allel auf der Grundlage der Signalstärke diskriminiert werden kann. Die Hybridisierungssonden, die zur spezifischen Hybridisierung zur Feststellung einer Ein-Basen-Fehlanpassung befähigt sind, können nach den auf dem Fachgebiet bekannten und in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbor, N. Y. und Berger und Kimmel, Methods in Enzymology, Bd. 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, CA; Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437; Kwok et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:999; Miyada et al. (1987) Methods Enzymol. 154:94 beschriebenen Methoden ausgelegt werden. Tm für Oligonukleotide wird unter Standardbedingungen (1M NaCl) als [4 C × (G + C) + 2°C × (A + T)] berechnet. Wenn sich auch die Bedingungen für PCR von den Standardbedingungen unterscheiden, wird dieses Tm doch als Anhaltspunkt für die erwarteten relativen Stabilitäten der Oligonukleotide verwendet. Allel-spezifische Primer sind im typischen Fall 13–15 Nukleotide lang, manchmal 16–21 Nukleotide lang oder noch länger; wenn kurze Primer verwendet werden, z. B. ein 14 Nukleotide langer Primer, werden niedrige Annealingtemperaturen verwendet, typischerweise 44 bis 50°C, gelegentlich etwas höher oder niedriger, je nach der Basenzusammensetzung der Sequenz(en).
  • BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Feststellung von Mutanten-Codon 717-APP-Allelen
  • In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren die Identifizierung einer genetischen Veränderung an Aminosäure 717, die bewirkt, dass die Consensus-Val geändert wird, zum Beispiel in einen anderen hydrophoben Rest. Dies wird an einer Probe ausgeführt, die der Versuchsperson entnommen wurde. Hydrophobe Reste sind u. a. Leu, Ala, Ile und Gly, wobei die ersten drei aliphatische Seitenketten besitzen. Phe besitzt auch einen hydrophoben Rest, der sich eignen könnte. Wie oben angegeben, sind die bevorzugten Reste Ile, Gly und Phe (Murrell et al. (1991) Science 254:97).
  • Die Tatsache, dass diese oben diskutierten Mutationen am selben Codon liegen, kann Zufall sein, dies erscheint aus statistischen Gründen aber unwahrscheinlich. Es gibt zwei Möglichkeiten zur Erklärung dieser Daten. Erstens kann eine Substitution des Valin-Restes an Codon 717 zu einer verstärkten β-Amyloidablagerung auf Grund von Änderungen im APP-Stoffwechsel führen. Zweitens kann die Veränderung in der Sequenz um diese Position herum zu einer verstärkten Translation von APP-mRNAs führen und so die Alzheimer-Krankheit durch eine Route analog zu der verursachen, von der man annimmt, dass durch sie die Alzheimer-Krankheit beim Down-Syndrom verursacht wird (Tanzi und Hyman (1991) Nature 350:564 und Rumble et al. (1989) N. Engl. J. Med. 320:1446). In situ-Hybridisierungsuntersuchungen haben gezeigt, dass APP 717-Mutationen die APP-Expression nicht verändern (Harrison et al. (1991) Neurorep. 2:152).
  • Die Mutationen V717I (APP 717 Val → Ile), V717G (APP 717 Val → Gly) und V717F (APP 717 Val → Phe) destabilisieren eine mutmaßliche Bäumchenstruktur und zerstören ein mögliches, auf Eisen reagierendes Element zwischen den Basenpaaren 2131 und 2156 (Tanzi und Hyman, a. a. O.). Es gibt mehrere andere mögliche Mutationen, die ebenfalls diese Struktur zerstören könnten, von denen viele auf der Proteinebene stumm sind; jedoch sind diese Mutationen, auf die verwiesen wurde, an einer Änderung an derselben Aminosäure beteiligt, und vor der hier beschriebenen Arbeit sind bisher noch keine stummen Veränderungen oder Veränderungen an anderen Aminosäuren angeführt worden. Die Untersuchung von Sequenzdaten von 10 anderen Sägetierarten (Johnstone et al. (1991) Mol. Brain Res. 10:299) zeigt, dass bei Beibehaltung des Valin-Restes an Codon 717 bei allen die aus der menschlichen Sequenz postulierte mutmaßliche Bäumchenstruktur (Tanzi und Hyman, a. a. O.) entsprechend der Vorhersage bei Rindern oder Schafen nicht auftreten sollte; und bei Schweinen und Mäusen ist die Consensus-Sequenz für die auf Eisen reagierenden Elemente nicht vorhanden. Schließlich nimmt man an, dass solche Bäumchenstrukturen die Gentranslation durch Änderung der mRNA-Stabilität modulieren (Klausner und Harford (1989) Science 246:870); jedoch haben Harrison und Kollegen (Harrison et al., a. a. O.) durch in situ-Hybridisierung gezeigt, dass APP-mRNAs bei der V7171-Mutation im Gehirn eines Individuums nicht sehr verändert werden. Aus diesen Gründen hält man es für wahrscheinlich, dass Änderungen an der Rate des APP-Übergangs, die durch die spezifischen Mutationen verursacht werden, wahrscheinlich nicht der Schlüssel zu ihrer Pathogenität sind.
  • Die Tatsache, dass die diskutierten Mutationen unterschiedliche Veränderungen mit sich bringen (Val → Ile, Val → Gly und Val → Phe) weist darauf hin, dass weder die Seitenketten-Hydrophobizität noch die Seitenkettenmenge der entscheidende Punkt sind. Alle Beispiele von APP-Allelen, die eine andere Aminosäure als Valin an Codon 717 codieren, kosegregieren mit FAD, was darauf hinweist, dass das Valin, welches an Position 717 in Wildtyp-APP770 oder APP751 auftritt, ein kritischer Aminosäurenrest für die nicht-pathogene proteolytische APP-Verarbeitung (d. h. durch den konstitutiven Spaltungsweg) ist.
  • Der metabolische Hauptweg für das APP-Molekül enthält die Spaltung innerhalb des β-Amyloidfragmentes (Esch et al., a. a. O.). Um β-Amyloid zu erzeugen, muss es einen zweiten Weg geben, auf dem APP außerhalb dieser Sequenz gespalten wird. Es wäre wahrscheinlich, dass eine solche Spaltung einen Stumpf des APP-Moleküls zurücklässt, der das in die Membran eingebettete β-Amyloidfragment enthält. Möglicherweise wird das β-Amyloid enthaltende Fragment, das durch den zweiten Weg erzeugt wird, durch Einwirkung von Peptidase zerlegt; die angeführten Mutationen können pathogen sein, weil Peptide, die diese enthalten, beständiger gegen die Wirkungen dieser Peptidase sein können. Daher sind genetische Veränderungen im APP-Gen, die zu geänderten (im allgemeinen reduzierten) Abbaueigenschaften führen, besonders wichtig bei der Anwendung der Erfindung. Es gibt mehrere Methodiken, die aus der rekombinanten DNA-Technik zur Verfügung stehen, die zur Feststellung und Identifizierung einer für die Alzheimer-Krankheit verantwortlichen genetischen Mutation verwendet werden können. Dazu gehören die direkte Sondierung, Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Methoden, Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus-Analyse (RLFP) und die Einzelstrang-Konformations-Analyse (SSCA).
  • Die Feststellung von Punktmutationen mittels direkter Sondierung umfasst die Verwendung von Oligonukleotidsonden, die synthetisch oder durch Nick-Translation hergestellt werden können. Die DNA-Sonden können geeignet markiert werden, wobei zum Beispiel eine radioaktive Markierung, Enzymmarkierung, fluoreszierende Markierung, Biotin-Avidin-Markierung und dergleichen für die nachfolgende Visualisierung, zum Beispiel für ein Southern-Blot-Hybridisierungsverfahren, verwendet wird. Die markierte Sonde wird mit der Proben-DNA umgesetzt, die an ein Nitrozellulose- oder Nylon 66-Substrat gebunden ist. Die Bereiche, die DNA-Sequenzen tragen, welche komplementär zu einer markierten DNA-Sonde sind, werden selbst als Folge der DNA-Renaturierungsreaktion markiert. Die Bereiche des Filters, die eine solche Markierung aufweisen, können dann visualisiert werden, zum Beispiel durch Autoradiographie.
  • Alternative Sondierungsverfahren, wie zum Beispiel die Ligase-Kettenreaktion (LCR), enthalten die Verwendung von Fehlanpassungssonden, d. h. Sonden, die vollständige Komplementarität mit dem Target, außer an der Mutationsstelle, besitzen. Die Targetsequenz kann dann sowohl mit volle Komplementarität besitzenden Oligonukleotiden als auch mit Oligonukleotiden hybridisieren, die eine Fehlanpassung besitzen, unter Bedingungen, durch die sich die beiden unterscheiden. Durch Veränderung der Reaktionsbedingungen ist es möglich, Hybridisierung nur dort zu erhalten, wo vollständige Komplementarität besteht. Wenn eine Fehlanpassung vorhanden ist, dann ist die Hybridisierung beträchtlich verringert.
  • Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein Verfahren, das spezifische DNA-Sequenzen mit bemerkenswerter Effizienz verstärkt. Wiederholte Zyklen von Denaturierung, Primer-Annealing und Ausdehnung, die mit dem wärmestabilen Enzym Taq-Polymerase ausgeführt werden, führen zu exponentiellen Anstiegen in der Konzentration der gewünschten DNA-Sequenzen.
  • In Anbetracht des Wissens über die Nukleotidsequenz, die den Vorläufer von Amyloidprotein der Alzheimer-Krankheit codiert (Kang et al., a. a. O. und Yoshikai, oben) ist es möglich, synthetische Oligonukleotide herzustellen, die komplementär zu Sequenzen sind, welche die interessierende DNA flankiert. Jedes Nukleotid ist komplementär zu einem mit zwei Strängen. Die DNA wird dann bei hohen Temperaturen (z. B. ca. 95°C) denaturiert und dann in Gegenwart eines größeren molaren Überschusses von Oligonukleotiden renaturiert. Die Oligonukleotide, die mit ihren aufeinander zeigenden 3'-Enden ausgerichtet sind, hybridisieren mit gegenüberliegenden Strängen der Targetsequenz und starten die enzymatische Ausdehnung entlang der Nukleinsäurenmatrize in Gegenwart der vier Desoxyribonukleotid-Triphosphate. Das Endprodukt wird dann für einen weiteren Zyklus denaturiert. Nachdem dieser Drei-Schritt-Zyklus mehrere Male wiederholt wurde, kann eine Verstärkung eines DNA-Segmentes um mehr als das Millionenfache erreicht werden. Die resultierende DNA kann dann direkt sequenziert werden, um eine genetische Veränderung zu lokalisieren. Alternativ ist es möglich, Oligonukleotide herzustellen, die nur an geänderte DNA binden, so dass die PCR nur zu einer Multiplikation der DNA führt, wenn die Mutation vorhanden ist. Nach der PCR kann mit der allel-spezifischen Oligonukleotidhybridisation (Dihella et al. (1988) Lancet 1:497) die Punktmutation der Alzheimer Krankheit festgestellt werden. Alternativ kann eine Anpassung der PCR genannten Verstärkung von spezifischen Allelen (PASA) eingesetzt werden; diese verwendet die differentielle Verstärkung zur schnellen und zuverlässigen Unterscheidung zwischen Allelen, die sich an einem einzigen Basenpaar unterscheiden.
  • Bei einer weiteren Methode kann der PCR die Verarbeitung mit Restriktionsendonuclease folgen, mit anschließender Analyse der sich ergebenden Produkte. Der Ersatz von T für C am Basenpaar 2149, der als Ergebnis des sequenzierenden Exons 17 gefunden wurde, erzeugt einen BclI-Restriktionsort. Die Erzeugung dieser Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle erleichtert die Feststellung der AD-Mutation unter Verwendung der RFLP-Analyse oder durch Feststellung des Vorhandenseins oder Fehlens einer polymorphen BclI-Stelle in einem PCR-Produkt, die das Codon 717 umfasst.
  • Für die RFLP-Analyse erhält man DNA zum Beispiel aus dem Blut der Versuchsperson, die im Verdacht steht, die Alzheimer-Krankheit zu haben, und von einer gesunden Person; diese wird mit Restriktionsendonuclease BclI aufgelöst und anschließend auf der Basis der Größe mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt. Das Southern-Blot-Verfahren kann dann dazu eingesetzt werden, durch Hybridisierung mit markierten Sonden die Produkte der Endonuclease-Auflösung festzustellen. Die vom Southern-Blot gewonnenen Muster können dann verglichen werden. Durch Einsatz einer solchen Herangehensweise wird DNA, die die Alzheimer-Mutation enthält, durch welche eine Restriktionsstelle an Codon 717 erzeugt oder entfernt wird, durch Bestimmen der Zahl der festgestellten Banden und durch Vergleich dieser Zahl mit einem Referenz-Allel ermittelt, das ein Valin codierendes Codon 717-Allel besitzt.
  • Dementsprechend erzeugt das Auswechseln von G für T am Basenpaar 2150 eine SfaNI-Restriktionsstelle (GCATC), die analog in einer ähnlichen Weise wie oben beschrieben genutzt werden kann. Die ähnliche Erzeugung von zusätzlichen Restriktionsstellen durch Nukleotidsubstitutionen innerhalb von Codon 717, wobei das Codon 717 eine andere Aminosäure als Valin codiert, kann leicht unter Bezugnahme auf den genetischen Code und eine Liste von Nukleotidsequenzen, die von Restriktionsendonucleasen erkannt werden, berechnet werden (Promega Protocols and Applications Guide, (1991) Promega Corporation, Madison, Wisconsin).
  • Die Einzelstrang-Konformations-Analyse (SSCA) (Orita et al. (1989) Genomics 5:874 und Orita et al. (1990) Genomics 6:271) stellt eine relativ schnelle Methode zur Feststellung von Sequenzänderungen dar, die zumindest in einigen Fällen geeignet sein kann.
  • Die PCR-Verstärkung von spezifischen Allelen (PASA) ist eine schnelle Methode zur Feststellung von Einzelbasen-Mutationen oder Polymorphien (Newton et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2503; Nichols et al. (1989) Genomics 5:535; Okayama et al. (1989) J. Lab. Clin. Med. 114:105; Sarkar et al. (1990) Anal. Biochem. 186:64; Sommer et al. (1989) Mayo Clin. Proc. 64:1361; Wu (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86:2757, und Dutton et al. (1991) Biotechniques 11:700). PASA (auch als allel-spezifische Verstärkung bekannt) umfasst die Verstärkung mit zwei Oligonukleotid-Primern, derart dass einer allel-spezifisch ist. Das gewünschte Allel wird wirksam verstärkt, während das/die andere(n) Allel(en) gering verstärkt werden, weil es eine Fehlanpassung mit einer Base am, oder in der Nähe des, 3'-Ende(s) des allel-spezifischen Primers besitzt. Daher kann PASA oder die verwandte Methode PAMSA zur spezifischen Verstärkung eines oder mehrerer abweichender APP-Codon 1717-Allelen verwendet werden. Wenn eine solche Verstärkung an genetischem Material (oder RNA), das von einem Individuum gewonnenen wurde, ausgeführt wird, kann diese Methode zur Feststellung des Vorhandenseins von einem oder mehreren abweichenden APP-Codon 717-Allelen in einem Individuum verwendet werden.
  • In ähnlicher Weise ist eine Methode, die als Ligase-Kettenreaktion (LCR) bekannt ist, erfolgreich zur Feststellung einer Einzel-Basen-Substitution in einem Hämoglobin-Allel verwendet worden, das die Sichelzellenanämie verursacht (Barany et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88:189; Weiss (1991) Science 254:1292). LCR-Sonden können kombiniert oder mehrfach angewendet werden, um gleichzeitig nach mehreren verschiedenen Mutationen zu suchen. Daher besteht eine Methode zum Screenen nach abweichenden APP-Codon 717-Allelen in der gleichzeitigen Anwendung von mindestens zwei, vorzugsweise allen LCR-Sonden, die ein APP-Allel mit einem Codon 717 feststellen, das kein Valin aber doch eine Aminosäure codiert. Der universelle genetische Code liefert die degenerierten Sequenzen für alle codierten Aminosäuren, die nicht Valin sind; daher ist die Gestaltung der LCR-Sonden zur Feststellung von besonderen abweichenden Codon 717-Allelen unkompliziert, und die Mehrfachpools von solchen LCR-Sonden können nach dem Ermessen eines Praktikers für seinen bestimmten gewünschten Einsatz ausgewählt werden.
  • Bei der Erstellung der Diagnose mit oben beliebig gewählten Methoden oder Abwandlungen derselben ist es vorzuziehen, mehrere Individuen zu untersuchen. Dazu können ein nicht betroffener Elternteil, ein betroffener Elternteil, ein betroffenes Geschwister, ein nicht betroffenes Geschwister sowie andere, eventuell entfernter verwandte Familienmitglieder gehören.
  • Modelltiere und Zelllinien
  • Nachdem spezifische Mutationen in Codon 717 des β-Amyloidgens als Ursache der familiären Alzheimer-Krankheit (FAD) festgestellt wurden, kann die genetische Manipulation zur Entwicklung von transgenen Modellsystemen und/oder ganzen Zellsystemen eingesetzt werden, die das mutierte FAD-Gen (oder einen Teil desselben) enthalten, um zum Beispiel nach Medikamenten zu suchen und die Wirksamkeit von Medikamenten zu bewerten. Zusätzlich stellen solche Modellsysteme ein Werkzeug zum Feststellen der zugrunde liegenden Biochemie des APP- und β-Amyloidstoffwechsels bereit, das dadurch eine Basis für den rationalen Entwurf von Medikamenten liefert.
  • Eine Art von Zellsystem kann auf natürliche Weise entwickelt werden. Dazu müssen von der betroffenen Person Blutproben gewonnen werden, um die notwendigen Zellen zu gewinnen, die dauerhaft in eine lymphoblastenähnliche Zelllinie transformiert werden können, zum Beispiel mittels des Epstein-Barr-Virus.
  • Nach dem Erstellen können solche Zelllinien zum kontinuierlichen Wachsen in Suspensionskultur gebracht werden und können für eine Reihe von in vitro-Experimenten eingesetzt werden, um APP-Expression und -Verarbeitung zu untersuchen.
  • Da die FAD-Mutation dominant ist, besteht eine alternative Methode zur Konstruktion einer Zelllinie darin, ein mutiertes Gen oder einen Teil desselben, der das Codon 717 enthält, genetisch in eine (stabil oder vorübergehend) etablierte Zelllinie der Wahl zu entwickeln. Sisodia (1990 Science 248:492) hat das Einbringen eines normalen APP-Gens durch Transfektion in Säugetierzellen beschrieben. Oltersdorf et al. (1990 J. Biol. Chem. 265:3392) beschreiben das Einbringen von APP in immortalisierte eukaryotische Zelllinien.
  • Baculovirus-Expressionssysteme sind Wir die Hochexpression von heterologen Genen in eukaryotischen Zellen nützlich. Knops et al. (1991) J. Biol. Chem. 266(11):7285 beschreibt die Expression von APP unter Verwendung eines solchen Systems.
  • In noch einer weiteren Verwendung der vorliegenden Methode kann es möglich sein, das mutierte Gen (d. h. ein abweichendes APP-Codon 717-Gen) zur Erzeugung von transgenen Tieren auszuschneiden, die das mutierte Gen enthalten. Zum Beispiel kann ein ganzes menschliches abweichendes APP-Codon 717-Allel geklont und, entweder in Teilen oder als Ganzes, in einen Klonierungs-Vektor (z. B. λCharon35, Cosmid oder künstliches Hefechromosom) isoliert werden. Das menschliche variante APP-Codon 717-Gen kann, entweder in Teilen oder als Ganzes, auf ein nicht-menschliches Wirtstier, wie z. B. eine Maus, übertragen werden. Im Ergebnis der Übertragung exprimiert das sich ergebende transgene nicht-menschliche Tier vorzugsweise ein oder mehrere variante APP-Codon 717-Polypeptide. Am meisten vorzuziehen ist es, wenn eine transgene Maus der Erfindung ein oder mehrere variante APP-Codon 717-Polypeptide in einer neuron-spezifischen Weise exprimiert (Wirak et al. (1991) EMBO 10:289). Dies kann durch Übertragen des im wesentlichen ganzen menschlichen APP-Gens (das eine Codon 717-Mutante codiert), einschließlich der 4,5 Kilobasen-Sequenz, die neben und stromaufwärts vom ersten größeren APP-Transkriptionsstartort liegt, erreicht werden.
  • Alternativ kann man Minigene entwerfen, die variante APP-Codon 717-Polypeptide codieren. Solche Minigene können eine CDNA-Sequenz enthalten, die ein variantes APP-Codon 717-Polypeptid, vorzugsweise von voller Länge, eine Kombination von APP-Gen-Exons oder eine Kombination derselben, die mit einer stromabwärts gelegenen Polyadenylierungs-Signalsequenz und einem stromaufwärts gelegenen Promotor (und vorzugsweise Enhancer) verbunden sind, codieren. Solch ein Minigen-Konstrukt exprimiert, wenn es in einen geeigneten transgenen Wirt übertragen wird (z. B. Maus oder Ratte), eine codiertes variantes APP-Codon 717-Polypeptid, vorzugsweise ein variantes APP-Codon 717-Polypeptid, das entweder einen Isoleucin-, Glycin- oder Phenylalaninrest an Codon 717 von APP770 oder an der entsprechenden Position in einer APP-Isoform oder einem Fragment enthält.
  • Eine Herangehensweise an die Schaffung von transgenen Tieren besteht darin, eine Mutation durch homologe Rekombination auf eine embryonale Stammzell(ES)-Linie in vitro zu richten, gefolgt von der Mikroinjektion der modifizierten ES-Zelllinie in einen Wirts-Blastozysten und nachfolgender Inkubation in einer Leihmutter (siehe Frohman und Martin (1989) Cell 56:145). Alternativ kann das Verfahren der Mikroinjektion des mutierten Gens oder eines Teils desselben in einen Ein-Zellen-Embryo, gefolgt von der Inkubation in eine Leihmutter angewendet werden. Verschiedene Verwendungen von transgenen Tieren, besonders transgenen Tieren, die eine Wildtyp-APP-Isoform oder ein Fragment exprimieren, werden in Wirak et al. (1991) EMBO 10(2):289; Schilling et al. (1991) Gene 98(2):225; Quon et al. (1991) Nature 352:239; Wirak et al. (1991) Science 253:323 und Kawabata et al. (1991) Nature 354:476 beschrieben. Weitere Methoden zur Herstellung transgener Tiere sind im Fachgebiet bekannt.
  • Alternativ können die ortsspezifische Mutagenese und/oder Genkonversion dazu verwendet werden, ein APP-Genallel der Maus (oder eines anderen nicht-menschlichen Tieres) entweder endogen oder transfiziert zu mutieren, derart dass das mutierte Allel kein Valin an der Codonposition im Mäuse-APP-Gen codiert, die dem Codon 717 (von APP770) des menschlichen APP-Gens entspricht (eine solche Position lasst sich leicht durch Homologieabgleich des Mäuse-APP-Gens oder APP-Proteins mit dem menschlichen APP-Gen oder APP770-Protein identifizieren). Vorzugsweise codiert solch ein mutiertes Mäuse-Allel Isoleucin oder Glycin oder Phenylalanin an der entsprechenden Codonposition.
  • Therapie
  • Nachdem man die genetische Mutation in der Gensequenz, die das β-Amyloidprotein codiert, in einem Individuum entdeckt hat, das noch keine offenkundigen Zeichen der familiären Alzheimer-Krankheit zeigt, ist es eventuell unter Verwendung der Methode der vorliegenden Erfindung möglich, die Gentherapie in der Form von Genimplantaten dazu einzusetzen, die Entwicklung der Krankheit zu verhüten.
  • Weitere Ausführungsformen, die darauf gerichtet sind, die Erzeugung von varianten APP-Proteinen zu modulieren, enthalten Methoden, die spezifische Antisense-Polynukleotide verwenden, welche komplementär zur ganzen oder zu einem Teil einer varianten APP-Sequenz oder für einige Ausführungsformen zu einer Wildtyp-APP-Sequenz sind. Solche komplementären Antisense-Polynukleotide können Nukleotidsubstitutionen, Hinzufügungen, Deletionen oder Transpositionen einschließen, solange die spezifische Hybridisierung an die relevante Targetsequenz, d. h. eine variante APP-Codon 717-Sequenz, als Eigenschaft des Polynukleotids erhalten bleibt. Daher muss ein Antisense-Polynukleotid vorzugsweise an eine variante APP-Sequenz (d. h. Codon 717 codiert kein Valin) im Gegensatz zu einem Wildtyp-APP (d. h. Codon 717 codiert Valin) binden. Es ist offensichtlich, dass das Antisense-Polynukleotid die exakte Nukleotidsequenz des varianten Allels (oder des Wildtyp-Allels, falls gewünscht) und keine degenerierte Sequenz widerspiegeln muss.
  • Komplementäre Antisense-Polynukleotide schließen lösliche Antisense-RNA- oder -DNA-Oligonukleotide ein, die speziell an eine variante APP-MRNA-Art hybridisieren und die Transkription der mRNA-Art und/oder Translation des codierten Polypeptids verhüten können (Ching et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86:10006; Broder et al. (1990) Ann. Int. Med. 113:604; Loreau et al. (1990) FEBS Letters 274:53–56; Holcenberg et al. WO91/11535 ; U.S.-Patent Nr. 7,530,165 („New human CRIPTO gene” – öffentlich erhältlich über Derwent Publications Ltd., Rochdale House, 128 Theobalds Road, London, Großbritannien); WO91/09865 ; WO91/04753 ; WO90/13641 und EP 386563 ). Die Antisense-Polynukleotide hemmen also die Produktion der varianten APP-Polypeptide. Antisense-Polynukleotide können vorzugsweise die Transkription hemmen, und/oder die Translation von mRNA, die einem varianten (oder Wildtyp-)Polypeptid entspricht, kann die T-Lymphozytenaktivierung hemmen.
  • Antisense-Polynukleotide können aus einer heterologen Expressionskassette in einer transfektanten Zelle oder einem Tier erzeugt werden, wie z. B. einer transgenen neuroglialen, glialen oder astrozytischen Zelle, vorzugsweise dort, wo die Expressionskassette eine Sequenz enthält, die die zelltypspezifische Expression fördert (Wirak et al., a. a. O.). Alternativ können Antisense-Polynukleotide lösliche Oligonukleotide enthalten, die dem äußeren Milieu hinzugefügt werden, entweder dem Kulturmedium in vitro oder dem Kreislaufsystem oder der interstitiellen Flüssigkeit in vivo. Es wurde nachgewiesen, dass lösliche Antisense-Polynukleotide, die im äußeren Medium vorhanden sind, Zugang zum Zytoplasma haben und die Translation spezieller mRNA-Arten hemmen. In einigen Ausführungsformen enthalten Antisense-Polynukleotide Methylphosphonat-Teile. Allgemeine Methoden, die sich auf Antisense-Polynukleotide beziehen, findet man in Antisense RNA and DNA, (1988), D. A. Melton, Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
  • Mutanten-APP-Antigene und Monoklonale Antikörper
  • Nachdem man eine genetische Veränderung in einer Gensequenz festgestellt hat, die für APP codiert, ist es in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung möglich, Proben des veränderten β-Amyloidproteins aus derselben Quelle zu gewinnen. Dieses Protein kann aus dem Hirngewebe einer Versuchsperson gewonnen werden, bei der diagnostiziert wurde, dass sie an der Alzheimer-Krankheit leidet, oder vorzugsweise durch rekombinante DNA-Methoden hergestellt oder durch direkte chemische Synthese auf einem festen Substrat synthetisiert werden. Solche Polypeptide enthalten eine Aminosäurensequenz eines varianten APP-Allels, das das Codon 717 enthält. Beispiele solcher Sequenzen sind:
    Figure 00220001
    Figure 00230001
  • Verwendet man solches Polypeptidmaterial, kann man Antiseren und monoklonale Antikörper herstellen, wobei zum Beispiel die Methode von Kohler und Milstein ((1975) Nature 256:495) verwendet wird. Solche monoklonalen Antikörper könnten dann die Grundlage eines diagnostischen Tests bilden.
  • Solche varianten APP-Polypeptide können dazu verwendet werden, ein Tier für die Herstellung von spezifischen Antikörpern zu immunisieren. Diese Antikörper können ein polyklonales Antiserum oder einen monoklonalen Antikörper enthalten, der von Hybridomzellen erzeugt wird. Allgemeine Methoden zur Herstellung von Antikörpern findet man in: Antibodies: A Laboratory Manual, (1988) E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
  • Zum Beispiel kann (ohne eine Beschränkung darzustellen) ein rekombinant hergestelltes Fragment eines varianten APP-Codon 717-Polypeptids einer Maus zusammen mit einem Zusatz injiziert werden, um so eine Immunreaktion hervorzurufen. Mäuse-Immunglobuline, die an das rekombinante Fragment mit einer Bindungsaffinität von mindestens 1 × 107 M–1 binden, können aus der immunisierten Maus als Antiserum gewonnen werden und durch Affinitäts-Chromatographie oder andere Mittel weiter gereinigt werden. Außerdem werden Milzzellen aus der Maus gewonnen und mit Myelomzellen verschmolzen, um eine Bank von Antikörper sezernierenden Hybridomzellen zu erstellen. Die Bank von Hybridomen kann nach Klonen durchsucht werden, die Immunglobuline absondern, welche sich an das rekombinant erzeugte Fragment mit einer Affinität von mindestens 1 × 106 M–1 binden. Genauer gesagt, werden Immunglobuline, die an das variante APP-Codon 717-Polypeptid binden, aber eine beschränkte Kreuzreaktivität mit einem Wildtyp-APP-Polypeptid (d. h. Codon 717 codiert Valin) besitzen, ausgewählt, entweder durch Vorabsorption mit Wildtyp-APP oder durch Screenen von Hybridom-Zelllinien nach spezifischen Idiotypen, die vorzugsweise die Variante und nicht den Wildtyp binden.
  • Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung, die in der Lage sind, schließlich die gewünschten varianten APP-Polypeptide zu exprimieren, können aus einer Vielfalt von verschiedenen Polynukleotiden (genomische oder cDNA, RNA, synthetische Oligonukleotide usw.) sowie durch eine Vielzahl von verschiedenen Verfahren gebildet werden.
  • Wie vorher festgestellt, werden die DNA-Sequenzen in Wirten exprimiert, nachdem die Sequenzen funktionsfähig mit einer Expressionskontrollsequenz (d. h. so positioniert, dass die Funktion der Expressionskontrollsequenz gesichert ist) verbunden wurden. Diese Expressionsvektoren sind im typischen Fall in den Wirtsorganismen entweder als Episomen oder als integraler Bestandteil der chromosomalen Wirts-DNA replizierbar. Üblicherweise enthalten Expressionsvektoren Selektionsmarker, z. B. Tetrazyklinresistenz oder Hygromycinresistenz, um die Feststellung und/oder die Auswahl derjenigen Zellen zu erlauben, die mit den gewünschten DNA-Sequenzen transformiert wurden (siehe z. B. US-Patent 4,704,362 ).
  • Polynukleotide, die ein variantes APP-Codon 717-Polypeptid codieren, können Sequenzen enthalten, die die Transkription (Expressionssequenzen) und Translation der codierenden Sequenzen erleichtern, derart dass das codierte Polypeptidprodukt hergestellt wird. Die Konstruktion solcher Polynukleotide ist im Fachgebiet bekannt und wird weiter in Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989) Cold Spring Harbor, NY, beschrieben. Zum Beispiel können (ohne als Beschränkung zu gelten) solche Polynukleotide einen Promotor, einen Transkriptionsterminationsort (Polyadenylierungsort in eukaryotischen Expressionswirten), einen Ribosomenbindungsort und gegebenenfalls einen Verstärker zur Anwendung in eukaryotischen Expressionswirten und gegebenenfalls Sequenzen enthalten, die für die Replikation eines Vektors benötigt werden.
  • E. coli ist ein prokaryotischer Wirt, der besonders zum Klonen der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung nützlich ist. Andere mikrobielle Wirte, die sich zur Verwendung eignen, sind u. a. Bazillen, wie z. B. Bacillus subtilus und andere Enterobakterien, wie z. B. Salmonella, Serratia und verschiedene Pseudomonas-Arten. Bei diesen prokaryotischen Wirten kann man auch Expressionsvektoren herstellen, die im typischen Fall Expressionskontrollsequenzen enthalten, welche kompatibel mit der Wirtszelle sind (z. B. ein Replikationsstartpunkt). Außerdem ist eine beliebige Zahl von bekannten Promotoren vorhanden, wie z. B. das Laktase-Promotorsystem, ein Tryptophan(trp)-Promotorsystem, ein β-Lactamase-Promotorsystem oder ein Promotorsystem vom Phagen Lambda. Die Promotoren kontrollieren im typischen Fall die Expression, gegebenenfalls mit einer Operatorsequenz, und besitzen Ribosomenbindungsort-Sequenzen und dergleichen zur Initiierung und Vervollständigung von Transkription und Translation.
  • Andere Mikroben, wie z. B. Hefe, können ebenfalls für die Expression eingesetzt werden. Saccharomyces ist ein bevorzugter Wirt mit geeigneten Vektoren, der Expressionskontrollsequenzen, z. B. Promotoren, einschließlich 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme, und einen Replikationsstartpunkt, Terminationssequenzen und dergleichen nach Wunsch besitzt.
  • Zusätzlich zu Mikroorganismen kann auch eine Säugetiergewebszellkultur zum Exprimieren und Herstellen der Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwendet werden (siehe Winnacker, „From Genes to Clones”, VCH Publishers, N. Y., N. Y. (1987)). Eukaryotische Zellen werden eigentlich bevorzugt, weil eine Reihe von geeigneten Zelllinien, die intakte menschliche Proteine sezernieren können, im Fachgebiet entwickelt worden sind, dazu gehören die CHO-Zelllinien, verschiedene COS-Zelllinien, HeLa-Zellen, Myelom-Zelllinien, Jurkat-Zellen usw. Expressionsvektoren für diese Zellen sind u. a. Expressionskontrollsequenzen, wie z. B. ein Replikationsstartpunkt, ein Promotor, ein Enhancer (Queen et al. (1989) Immunol. Rev. 89:49) und notwendige Verarbeitungsinformationsorte, wie z. B. Ribosomenbindungsorte, RNA-Spleißstellen, Polyadenylierungsstellen und Transkriptionsterminatorsequenzen. Bevorzugte Expressionskontrollsequenzen sind Promotoren, die aus Immunglobulingenen, SV40, Adenvirus, Rinderpapillomvirus und dergleichen abgeleitet sind. Vektoren, die DNA-Segmente von Interesse enthalten (z. B. Polypeptide, die ein variantes APP-Polypeptid codieren), können in die Wirtszelle mit bekannten Methoden übertragen werden, die sich je nach der Art des zellulären Wirts ändern. Zum Beispiel wird die Calciumchlorid-Transfektion häufig für prokaryotische Zellen verwendet, während die Calciumphosphat-Behandlung oder Elektroporation für andere zelluläre Wirte verwendet werden kann. (Siehe allgemein Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1982)).
  • Alternativ kann eine homologe Rekombination dazu verwendet werden, eine APP-Mutantensequenz in ein Wirtsgenom an einer spezifischen Stelle, zum Beispiel an einem Wirts-APP-Locus einzufügen. Bei einer Art von homologer Rekombination werden ein oder mehrere Wirtsequenz(en) ausgewechselt; zum Beispiel wird ein Wirts-APP-Allel (oder ein Teil desselben) durch ein Mutanten-APP-Allel (oder einen Teil desselben) ersetzt. Zusätzlich zu solchen Genersetzungsmethoden kann die homologe Rekombination dazu eingesetzt werden, ein Mutanten-APP-Allel auf einen speziellen Ort, der sich von einem APP-Locus unterscheidet, zu richten. Mit der homologen Rekombination können transgene nicht-menschliche Tiere und/oder Zellen hergestellt werden, die Mutanten-APP-Allele enthalten.
  • Die Methode selbst eignet sich unmittelbar für die Bildung von Testbausätzen, die in der Diagnostik eingesetzt werden können. Solch ein Bausatz enthält einen Träger, der streng begrenzt auf einen oder mehrere Container aufgeteilt ist, wobei ein erster Container geeignet markierte DNA-Sonden enthalten kann. Andere Container können Reagenzien enthalten, die nützlich bei der Lokalisierung der markierten Gene sind, wie z. B. Enzymsubstrate. Weitere Container können ein Restriktionsenzym (wie z. B. BclI), Puffer und dergleichen, zusammen mit einer Gebrauchsanweisung enthalten.
  • EXPERIMENTELLE BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung angeführt und sollen die Erfindung nicht auf das speziell angeführte Beispiel beschränken.
  • BEISPIEL I – Feststellung einer Val → Ile-Mutation in einem β-Amyloid(APP)-Gen
  • Die Segregation der Alzheimer-Krankheit und der Marker am langen Arm von Chromosom 21 in einer einzelnen Familie mit der durch Autopsie bestätigten Alzheimer-Krankheit (siehe 1) wurde untersucht. DNA-Proben standen aus insgesamt 6 betroffenen und 33 nicht betroffenen und vom Risiko gefährdeten Individuen zur Verfügung.
  • Das APP-Gen in einem betroffenen Familienmitglied wurde mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Direktsequenzierung unter Verwendung intronischer Primer analysiert (Gyllenstein, U. in: PCR Technology, Hrsg. Erlich, H. A., Stockton Press, 45–60, 1989; Yoshikai et al. (1990) Gene 87:257) (2). Die Primer wurden entsprechend dem Protokoll des Herstellers mit einem Gene Assembler Plus (Pharmacia LKB) hergestellt.
  • Die PCR wurde mit den folgenden Primer ausgeführt, um Exon 17 des APP-Gens zu verstärken:
    Figure 00270001
  • Die PCR-Bedingungen waren 94°C für 10 min zur Denaturierung; dann 35 Zyklen von 60°C für 1 min, 72°C für 3 min, 94°C für 1,5 min, und ein einziger Zyklus von 72°C für 10 min. Die Reaktion wurde mit 10 mM tris-HCl, pH 8,3, 50 mM Kaliumchlorid, 0,01% Gelatine, 1,5 mM Magnesiumchlorid, 200 μM dNTPs, 50 pmol von jedem PCR-Primer und 1 Einheit Taq-Polymerase durchgeführt. Das gesamte Endreaktionsvolumen betrug 25 μl.
  • Eine zweite PCR-Reaktion wurde dann mit einer Endkonzentration von 50 pmol von Primer [A] und 0,5 pmol von Primer [B] durchgeführt. Das PCR-Produkt wurde in einem Centricon-Mikrokonzentrator (Amicon) gereinigt und direkt für die Sequenzierung mit dem SEQUENASE-Kit (Version 2.0, United States Biochemical Corp., der Begriff SEQUENASE ist ein Warenzeichen) entsprechend dem Herstellerprotokoll verwendet.
  • Exon 17 wurde zuerst sequenziert, weil es einen Teil des β-Amyloidpeptids codiert und der Ort der Mutation (bei APP693) ist, die zur Hereditären Hirnblutung mit Amyloidose vom Typ Dutch (HCHWA-D) führt.
  • Die Sequenzierung von Exon 17 zeigte einen C → T-Übergang an Basenpaar 2149, der bewirkt, dass Valin durch Isoleucin bei Aminosäure 717 ersetzt wird (2 und 3).
  • Dieser C → T-Übergang erzeugt einen BclI-Restriktionsort, der die Feststellung im PCR-Produkt ermöglicht (4). BclI-Abbauvorgänge wurden bei 50°C über 2–4 Stunden ausgeführt, wie vom Hersteller empfohlen, dann einer Elektrophorese in 3%iger Agarose unterzogen.
  • Das Screening mit PCR von 100 nicht verwandten, normalen Individuen und 14 Fällen (9 Familien) mit familiärer spät ausbrechender Krankheit hat diese Substitution nicht gezeigt. Das Screening von 11 Fallen (9 Familien) mit familiärer früh ausbrechender Krankheit zeigte den BclI-Restriktionsort bei zwei betroffenen Individuen aus einer nicht verwandten Familie. Die genetischen Daten zeigen, dass die Krankheits-Loci mit der Fehlsinnmutation verbunden sind. Die Nichtfeststellung dieser Polymorphie in 200 normalen Chromosomen stützt ebenfalls die Behauptung, dass dies eine pathogene Mutation ist.
  • Die Valin → Isoleucin-Substitution tritt innerhalb der Transmembrandomäne zwei Reste vom C-Terminus des β-Amyloidpeptids auf. Die Computeranalyse sagt vorher, dass die Substitution den Transmembranbereich hydrophober macht und daher das Protein fester in der Membran verankern könnte. Die Position der Substitution, zwei Reste vom C-Terminus des β-Amyloidpeptids, kann für den Ursprung des abgelagerten Peptids von Bedeutung sein. Diese Erkenntnis verknüpft die Alzheimer-Krankheit mit HCHWA-D, einer Krankheit, bei der die Amyloidablagerung auf einen Mutation zurückzuführen ist, welche näher am N-Terminus, aber innerhalb des β-Amyloidpeptids liegt (Levy et al., a. a. O.).
  • BEISPIEL 2 – Herstellung einer Zelllinie, die ein defektes β-Amyloid(APP)-Gen enthält
  • 10 ml Frischblut werden jedem Individuum abgenommen, das an der familiären Alzheimer-Krankheit leidet. Lymphozyten aus dem Blut werden mit einem Percoll-Gradienten gereinigt und mit Epstein-Barr-Virus (EBV) gemischt. Die Zellen werden dann in ein Medium ausplattiert, das mit 10% fötalem Kalbsserum, Antibiotika, Glutamin und Cyclosporin A zum Abtöten der T-Lymphozyten versetzt wird. B-Lymphozyten, die durch EBV infiziert sind, werden immortalisiert und bilden eine dauerhafte Zelllinie, die aus den B-Zellen des Patienten abgeleitet sind.
  • Eine lymphoblastenartige Zelllinie, AC21, wurde bei der Europäischen Sammlung von Tierzellkulturen, Porton Down, hinterlegt.
  • BEISPIEL 3 – Feststellung einer Val → Gly-Mutation im β-Amyloid(APP)-Gen
  • Ein Stammbaum, F19 genannt und in 5 gezeigt, der durch Autopsie gesicherte Alzheimer-Krankheit mit einem Alter bei Ausbruch von 59 ± 4 Jahren zeigt, wurde durch die Beobachtung identifiziert, dass ein Allel des stark polymorphen Dinukleotid-Wiederholungsmarkers GT12 (D21S210), der sich dicht beim APP-Gen befindet, mit der Krankheit co-segregierte. Die Kopplungsanalyse ergab einen Spitzen-LOD Score-Wert zwischen dem Marker und der Krankheit von 3,02 bei einer Kombinationsfraktion von 0, wie die folgende Tabelle zeigt:
    Theta 0 0,01 0,05 0,1 0,2 0,3 0,4
    LOD 3,02 2,97 2,75 2,47 1,86 1,22 0,6
  • LOD-Scorewerte wurden mit sieben Anfälligkeitsklassen berechnet, die die altersabhängigen Penetranzen von 0,01 bis 0,95 bei einer Phänokopierate von 0,01 und einer Genhäufigkeit von 0,001 unter Verwendung von MLINK aus dem LINKAGE-Programmpaket (Lathrop et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3443) modellieren.
  • Es wurden die APP-Exon 17-Sequenzen in einem betroffenen und einem nicht betroffenen Mitglied von F19 bestimmt. Beim betroffenen Mitglied bestand ein G → T-Übergang an Position 2150, wie aus 6 zu ersehen ist.
  • Exon 17 wurde so verstärkt, wie in Beispiel 1 oben und bei Chartier-Harlin et al. (1991) Neurosci. Letts. 129:134 beschrieben, mit folgenden Modifikationen: a) Die Verstärkungs-Primer-Sequenzen waren:
    Figure 00290001
    • b) Die PCR-Bedingungen waren 94°C/10 Minuten, dann 35 Zyklen von 60°C/1 Minute, 72°C/1 Minute, 94°C/1 Minute, gefolgt von 72°C/5 Minuten.
  • 50 pmol des zweiten Primers wurden dazu verwendet, das einsträngige Produkt zu erzeugen, das dann gereinigt wurde (Chartier-Harlin et al., a. a. O.). Das gereinigte Produkt wurde mit dem SEQUENASE-Kit (2.0) (Warenzeichen; USB) mit einem Primer der Sequenz:
    AAA-TGA-AAT-TCT-TCT-AAT-TGC-G [SEQ ID NR:30]
    sequenziert.
  • Das Vorhandensein des T → C Überganges schafft Gel-Artefakte, die durch Einschluß von Inosin (SEQUENASE KIT) bei der Sequenzierungsreaktion aufgelöst wurden.
  • Die direkte Sequenzierung der Exons 7 und 16 aus betroffenen Individuen aus F19 (Chartier-Harlin et al., a. a. O.) zeigt, dass sie eine normale Sequenz aufwiesen und dass SSCA (Orita et al., a. a. O. und Orita et al.) keine Änderungen in den Exons 2, 3, 7, 9, 12, 13 oder 15 identifizieren konnte. SSCA von Exon 17 stellt sowohl APP693 (Levy et al., a. a. O. und Hardy et al. (1991) Lancet 337:1342–1343) als auch APP717-Val → Ile unter normalen Screening-Bedingungen und bei modifiziertem APP717-Val → Gly fest.
  • BEISPIEL 4 – Herstellung von transgenen Tieren mit Mutanten-APP-Allelenerzeugung der Konstrukte
  • Der Vektor plink wurde durch klonierende Polylinker zwischen den Stellen PvuII und EcoRI von pBR322 derart konstruiert, dass das HindIII-Ende des Polylinkers neben der PvuII-Stelle lag. Die Ligation zerstörte die EcoR1- und PvuII-Stellen, die mit den pBR322-Segmenten verbunden waren. Das 700 Basenpaare große Hpa1-bis-EcoR1-Fragment von pSV2neo (Southern und Berg (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:327), das das SV40-Polyadenylierungssignal enthält, wurde in die HpaI- bis EcoR1-Stellen von plink hineinkloniert, um pNotSV zu erzeugen. Das 200 Basenpaare große XhoI-bis-PstI-Fragment, das die SV40-16S/1gS-Spleißstelle enthält (Okayama und Berg (1983) Mol. cell Biol. 3:280), wurde isoliert, mit Klenow abgestumpft, dann in die HpaI-Stelle von pNotSV hineinkloniert, um pSlice zu erzeugen. Das 2300 Basenpaare große Nru1-bis-SpeI-Fragment von pAPP695, das die Codierregion der cDNA für APP enthält (Tanzi et al. (1987) Science 235:880), wurde in die NruI-bis-SpeI-Stelle von pSplice hineinkloniert, um pd695 zu erzeugen. Dieselbe Strategie wurde verwendet, um pd751 unter Verwendung der cDNA für APP751 zu erzeugen (Tanzi et al. (1988) Nature 331:528). Eine Reihe von Promotoren wurde in die Vektoren pd695 und pd751 unter Verwendung der alleinigen NruI-Stelle oder der HindIII- und NruI-Stellen eingefügt.
  • Erzeugung von pshAPP695 und pshAPP751
  • Das Konstrukt pAmyproBam wurde durch Klonieren des 1500 Basenpaar großen BamHI-Fragmentes der APP-cDNA in die BamHI-Stelle von puc19 xHamy erzeugt. Das 700 Basenpaar große HindIII-bis-Asp718-Fragment des pAmyproBam (ähnlich dem 700 Basenpaar großen BamHI-bis-Asp718-Fragment, das in Salbaum et al. (1988) EMBO 7:2807 beschrieben wurde) wurde in die Stellen HindIII bis Asp718 von pd695 und pd751 hineinkloniert, um pshAPP695 und pshAPP751 zu erhalten.
  • pAPP695 und pAPP751
  • Die Vektoren pAPP695 und pAPP751 wurden durch eine Dreifachligation des 3000 Basenpaar großen EcoRI-bis-XhoI-Fragments von pAmyProBam, des 1500 Basenpaar großen XhoI-bis-SpeI-Fragments von APP751 cDNA und der SpeI-bis-EcoRI-Stelle von pd751 erzeugt.
  • Erzeugung von pNSE751(+47)
  • pNSE751(+47) wurde unter Verwendung der Dreifachligation des HindIII-bis-KpnI-Fragments von pNSE6 konstruiert (Forss-Peter et al. (1990) Neuron 5:187). Das KpnI-bis-BstY1-Fragment von pNSE6 und ein Teil-BamH1(-47nt relativ zum ATG)-bis-HindIII-Fragment von pAPP751. Das führte zur Erzeugung eines KpnI-Fragments, das in die KpnI-Stellen von pNSE751(+47) hineinkloniert wurde. Die BstY1-Bam-Fusion führt zum Verlust beider Stellen.
  • Erzeugung von pNSE751
  • Dieser Vektor wurde unter Verwendung eines Vier-Primer-Zwei-Stufen-PCR-Protokolls erzeugt (Higuchi et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:7351), was zu einer direkten Fusion des NSE-Initiationscodons mit der APP-Codierregion führte. Es wurden die Oligonukleotide C2, 1072, 1073 und A2 (siehe Nukleotidsequenzen, unten) zur Erzeugung eines PCR-Produktes verwendet. Das KpnI-Fragment wurde durch Zerlegung mit dem Restriktionsenzym erzeugt. Das KpnI-Fragment wurde verwendet, um ein ähnliches Fragment in pNSE751(+47) zu ersetzen.
  • Erzeugung von pNSE751-Hardy und pNSE751-Dutch
  • Die Hardy-(APP642-Val → Ile von APP695) und Dutch-Mutationen (APP618-Gln → Glu von APP695) wurden mit einem Vier-Primer-Zwei-PCR-Protokoll eingeführt. Beide Reaktionssätze verwendeten dieselben „Außen-Primer” mit den „Innen-Primern”, die die geeigneten Mutationen enthalten. Dies führte zur Erzeugung des BglII-bis-SpeI-Fragments nach Digestion, die entweder die Durch- oder die Hardy-Mutation enthielt. Das BglII-bis-SpeI-Fragment von pNSE751 wurde durch das mutierte Fragment ersetzt, um den geeigneten Vektor zu erzeugen. Das Vorhandensein der Mutation wurde durch Sequenzanalyse der Vektoren bestätigt.
  • Erzeugung von pNSE751-Hardy und pNSE751-Dutch
  • Die Mutationen Hardy VI (APP642 V bis I), Hardy VG (APP642 V bis G) und Dutch (APP618 E bis Q) wurden mittels Vier-Primer-Zwei-Schritt-PCR-Protokoll (Higuchi et al. (1988)) eingeführt. Die Hardy VI-Mutante wurde mit den Primern 117/738, 922, 923 und 785 erzeugt; die Hardy VG-Mutante wurde mit den Primern 117/738, 1105, 1106 und 785 erzeugt; die Dutch-Mutante wurde mit den Primern 117/738, 1010, 1011 und 785 erzeugt. Bei allen diesen Mutationen wurde das 700 Basenpaar große BglII-bis-SpeI-Fragment durch Digestion des PCR-Produkts mit den Restriktionsenzymen isoliert, dann in dieselben Stellen von pNSE751 hineinkloniert. Die Mutationen wurden durch Sequenzanalyse bestätigt.
  • Erzeugung von pNFH751
  • Das menschliche NFH-Gen (Lees et al. (1988) EMBO 7(7):1947) wurde aus einer Genombank unter Verwendung von Ratten-NFH-cDNA als Sonde isoliert (Lieberburg et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2463). Ein SstI-Fragment wurde in den pSK-Vektor subkloniert. Ein Paar von PCR-Primern wurde erzeugt, um eine NruI-Stelle an das 3'-Ende des 150 Basenpaar großen verstärkten Fragments unmittelbar stromaufwärts vom Initiationscodon des NFH-Gens zu bringen. Das 5'-Ende enthält eine KpnI-Stelle 150 nt stromaufwärts vom Initiationscodon. Die Endkonstruktion von pNFH751 wurde durch Dreifachligation des 5,5 b großen HindIII-bis-KpnI-Fragments von pNFH8.8, des per PCR erzeugten KpnI-bis-NruI-Fragments und des HindIII-bis-KpnI-Fragments von pd751 erzeugt. Die Sequenz, die die per PCR erzeugte Fusion am Initiationscodon umgibt, wurde durch Sequenzanalyse bestätigt. Die Varianten Dutch und Hardy von pNFH751 wurden durch Substitution des 600 Basenpaar großen BglII-bis-SpeI-Fragments aus einem sequenzbestätigten mutierten Vektor für dasselbe Fragment von pNFH751 erzeugt. Das Vorhandensein der Mutation wurde durch Hybridisierung mit dem mutierten Oligomer oder durch Sequenzanalyse bestätigt.
  • Erzeugung von pThy751
  • Der pThy751-Vektor wurde durch eine Dreifachligation erzeugt: Das HindIII-bis-BamHI-Fragment von pThy8.2, das aus einer menschlichen Genombank isoliert wurde (Chang et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3819), das synthetische Fragment ThyAPP und das HindIII-bis-NruI-Fragment von pd751.
  • ThyAPP:
    • CAGACTGAGATCCCAGAACCCTAGGTCTGACTCTAGGGTCTTGG [SEQ ID NR:31]
  • Erzeugung von pThyC100
  • Dieses pThyC100-Konstrukt wurde durch eine Dreifachligation erzeugt. Das 3.6 kb große Hind III bis BamHI-Fragment von pThy8.2, das synthetische Fragment ThyAPP2 und das HindIII-bis-BglII-Fragment von pd751 oder pNSE751 Dutch oder pNSE751 Hardy wurden ligiert, um pThyC100 zu erhalten.
  • ThyAPP2:
    • CAGACTGAGATCCCAGAACCGATCCTAGGTCTGACTCTAGGGTCTTGG [SEQ ID NR:32]
  • Die Region um das Inibiierungscodons wurde durch Sequenzanalyse bestätigt.
  • Herstellung von DNA zur Injektion
  • Das Transgen zur Injektion wurde aus dem entsprechenden interessierenden Vektor zur Digestion mit NotI und Gelelektrophorese isoliert. Das Transgen wurde mittels Gene Clean-Kit (Bio101) gereinigt, dann weiter auf einem Elutip gereinigt oder auf einer Nucleogen 4000-Säule mit HPLC gereinigt.
  • Mikroinjektion
  • Das Transgen wurde mit 2–20 μg/ml in den geeignetsten Pronukleus (gewöhnlich den männlichen Pronukleus) von FVB- oder B6D2F2-Einzell-Embryos injiziert (Manipulating the Mouse Embryo, B. Hogan, F. Constantini, E. Lacy, Cold Spring Harbor, 1986). Die Embryos, denen die Injektionen verabreicht wurden, wurden über Nacht kultiviert. Embryos, die sich zum Zwei-Zellen-Stadium teilten, wurden in pseudogravide weibliche CD1-Mäuse eingesetzt. Die Mäuse wurden nach ca. 21 Tagen entwöhnt. Durch eine Schwanzbiopsie gewonnene DNA-Proben wurden durch Southern-Blot mit einer transgenspezifischen Sonde (normalerweise die SV40-3's-Spleiß- und Polyadenylisierungssignalsequenzen) analysiert. Transgen Mäuse, die mindestens eine Kopie des Transgens enthielten, wurden identifiziert.
  • Verwendung transgener Mäuse: Eine Maus, die das hAPP-Gen oder seine Varianten exprimiert, kann zum Testen der Pathogenese der Amyloidablagerung und zur therapeutischen Intervention, die zur Modulierung der Amyloidablagerung bestimmt ist, eingesetzt werden.
  • Die biochemische Analyse der transgenen Mäuse zeigt mögliche Zwischenstufen im Katabolismus von APP auf, die wahrscheinlich Vorläufer für β-Amyloid sind. Diese Analyse kann im Tier oder in primärer Gewebskultur der exprimierenden Zellen ausgeführt werden.
  • Das Tier kann dazu eingesetzt werden, potenzielle therapeutische Mittel zu testen. Die Testgruppe von Mäusen wird mit der Testverbindung behandelt, die in einer geeigneten Weise über einen festgelegten Zeitraum verabreicht wird. Am Ende des Testzeitraums werden die Tiere verhaltenphysiologisch, biochemisch und histologisch auf mögliche Effekte der Testverbindung untersucht. Das exakte Protokoll hängt vom erwarteten Mechanismus der Wirkung der Testverbindung ab. Mit dieser Herangehensweise können Verbindungen, die einen Nutzen bei der Behandlung der Alzheimer-Krankheit besitzen, identifiziert werden. SEQUENZLISTE
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Claims (24)

  1. Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz aufweist, welche ein mutiertes Allel eines humanen Amyloid-Voräuferproteins (APP) kodiert, welches mit einer genetischen Prädisposition für früh auftretende Alzheimer-Krankheit kosegregiert, wobei das mutierte APP-Allel eine Aminosäuresubstitution an der Position aufweist, die durch Codon 717, definiert in Bezug auf APP770, kodiert wird.
  2. Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, wobei das APP APP770 ist.
  3. Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Aminosäure an der durch Codon 717 kodierten Position Isoleucin ist.
  4. Isoliertes Polynukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäuresequenz eine cDNA ist.
  5. Zusammensetzung, die eine Polynukleotidsonde aufweist, die in der Lage ist spezifisch an ein Allel des Amyloid-Voräuferprotein 770 (APP770), welches eine Mutation an Codon 717 aufweist, zu hybridisieren, sodass auf einem Southern-Blot eine Bande welche dem APP770-Allel entspricht, identifiziert werden kann, wohingegen ein entsprechendes Wildtyp-Allel nicht identifiziert, oder aufgrund der Signalintensität von dem APP770-Allel unterschieden werden kann.
  6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei Codon 717 des mutierten Allels Isoleucin kodiert.
  7. Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Sonde markiert ist.
  8. Transgener Wirt, der ein rekombinantes Polynukleotid aufweist, das eine Nukleinsäuresequenz enthält, die ein mutiertes Allel des humanen Amyloid-Vorläuferprotein (APP) kodiert, das mit einer genetischen Prädisposition für früh ausbrechende Alzheimer-Krankheit kosegregiert, wobei der Wirt kein Mensch ist, und wobei das mutierte APP-Allel eine Aminosäurensubstitution an der Position die durch Codon 717, in Bezug auf APP770 definiert, kodiert wird, und wobei falls der Wirt ein Tier ist, der Wirt eine Maus ist.
  9. Wirt nach Anspruch 8, wobei die Aminosäure an der durch Codon 717 kodierten Position Isoleucin ist.
  10. Wirt nach Anspruch 8 oder 9, welcher eine primäre oder immortalisierte eukaryotische Zelllinie ist.
  11. Wirt nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das mutierte APP-Allel APP770 ist.
  12. Verwendung einer transgenen Maus die ein mutiertes APP-Gen aufweist, als ein Modell für früh ausbrechende Alzheimer-Krankheit, wobei das mutierte APP-Gen ein mutiertes Codon 717 hat.
  13. Kultivierte humane primäre oder immortalisierte Zelle, die eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die eine Position 717-Mutante des humanen Amyloid-Vorläuferproteins (APP770), oder eine APP-Isoform welche die Mutation aufweist, kodiert.
  14. Verfahren zum Durchsuchen auf ein Agens das in der Lage ist die früh ausbrechende Alzheimer-Krankheit zu behandeln, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: das in Kontakt bringen eines Wirtes nach einem der Ansprüche 8 bis 11 mit dem Agens; und das Überwachen der Expression oder Prozessierung von Proteinen, die durch das mutierte Allel kodiert werden.
  15. Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins des Gens für früh ausbrechende Alzheimer-Krankheit, in einer Nukleinsäure oder einer anderen Probe die einem Probanden entnommen wurde, wobei das Verfahren das Identifizieren einer genetischen Änderung in einer Gensequenz, die das Amyloid-Vorläuferprotein (APP) kodiert, umfasst, wobei die genetische Änderung eine Mutation in Codon 717 ist.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Aminosäure an der durch Codon 717 kodierten Position Isoleucin ist.
  17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das APP APP770 ist.
  18. Diagnoseverfahren zur Bestimmung einer ererbten Prädisposition für früh ausbrechende Alzheimer-Krankheit in einem Probanden, das den Nachweis des Vorhandenseins eines Allels des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) umfasst, wobei das Allel einen Sequenzpolymorphismus an einer Stelle die der Position des Codons 717 von APP entspricht, aufweist, sowie weiters den Schritt des Detektierens an Material das dem Körper des Probanden entnommen wurde und diesem nicht zurückgeführt wird, umfasst.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Sequenzpolymorphismus eine Nukleotidsubstitution ist, wobei ein Isoleucin oder Glycin bei Codon 717 des APP 778 substituiert ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei der Sequenzpolymorphismus die Substitution eines einzelnen Nukledotids darstellt.
  21. Verfahren nach Anspruch 18, 19 oder 20, wobei der Nachweisschritt das Sequenzieren eines genomischen DNA-Segments aus Chromosom 21 des Probanden umfasst, welches das besagte Allel kodiert.
  22. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei der Nachweisschritt Folgendes umfasst: (i) das Mischen einer Nukleinsäureprobe des Probanden mit einer oder mehreren Polynukleotidsonden, welche in der Lage sind in einem Reaktionsgemisch selektiv an das Allel des APP-Gen zu hybridisieren, sodass auf einem Southern-Blut eine Bande welche dem APP770-Allel entspricht, identifiziert werden kann, wohingegen ein entsprechendes Wildtyp-Allel nicht identifiziert, oder aufgrund der Signalintensität von dem APP770-Allel unterschieden werden kann, und (ii) die Überwachung der Reaktion zur Bestimmung des Vorhandenseins des Allels des Gens in der Probe, wodurch angezeigt wird ob der Proband gefährdet für die Alzheimer-Krankheit ist.
  23. Verfahren für die genetische Analyse eines humanen Probanden, welches die Detektion des Vorhandenseins oder des Fehlens von zumindest einem Polymorphismus an Codon 717 eines APP770-Gens eines Amyloid-Vorläuferprotein(APP)-Gens in dem Probanden umfasst, wobei der Nachweisschritt an Material durchgeführt wird, das dem Körper des Probanden entnommen wurde und diesem nicht zurückgeführt wird.
  24. Zusammensetzung die frei von humanen Porteinen ist, welche ein Polypeptid aufweist, das die folgende Kernsequenz aufweist: Ile-Ala-Thr-Val-Ile-X-Ile-Thr-Leu- [SEQ ID Nr.: 6], wobei X eine beliebige der zwanzig konventionellen Aminosäuren außer Valin ist.
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