-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Differenzierung
von Monozyten in reife dendritische Zellen, bei welchem Monozyten
zur Differenzierung in einem geeigneten Medium bereitgestellt werden, und
wobei L-α-Lysophosphatidylcholin
zu dem Medium hinzugefügt
wird.
-
Dendritische
Zellen sind bei der Entwicklung einer Immunantwort und bei der Auslösung einer
spezifischen T-Lymphozytenantwort durch Erkennung, Aufnahme und
Präsentation
der Antigene, insbesondere infektiöse Stoffe, beteiligt (Steinman
et al., 1997, Immuno. Rev., 156: 25–37; Cella et al., 1997, Curr.
Opin. Immunol., 9: 10–16).
Während
unreife dendritische Zellen die Antigene infektiöser Stoffe sehr effektiv aufnehmen und
abbauen können,
so können
bestimmte Signale, wie bspw. bakterielle Stoffe oder entzündliche
Zytokine, sie durch die Injizierung eines Reifungsprozesses aktivieren,
welches den Anfangsschritt bei der Auslösung der adaptiven Immunantwort
darstellt. Tatsächlich
erlangen die dendritischen Zellen während dieser Aktivierung die
Fähigkeit,
in die lymphoiden Organe zu wandern, wo T-Lymphozyten vorliegen,
und ferner die Fähigkeit,
costimulierende Signale zu übermitteln,
die für
die Aktivierung der nativen T-Lymphozyten essentiell sind. Während dieser
Reifung unterlaufen die dendritischen Zellen einer Reihe von funktionellen
und phänotypischen
Modifizierungen, wie beispielsweise:
- • ein Anstieg
in den Oberflächenmolekülen, die
bei der Aktivierung der T-Lymphozyten beteiligt sind (wie bspw.
CD40, CD80, CD83, CD86 sowie die Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes
(major histocompatibility complex, MHC, Klasse I und Klasse II),
- • die
Produktion proinflammatorischer Cytokine (wie bspw. die Interleukine
IL-12, IL-1β,
TNFα und
IL-6),
- • ein
Abfall in deren Fähigkeit,
das Antigen aufzunehmen und zu prozes
sieren.
-
Auf
Grund ihrer Fähigkeiten,
eine Immunantwort zu entwickeln, und eine spezifische T-Lymphozyten-Antwort
auszulösen,
sind reife dendritische Zellen von besonderem therapeutischen Interesse,
insbesondere im Gebiet der anti-infektiösen und Anti-Tumor-Impfung
und im Gebiet der Immunotherapie (Austin. 1998, Curr. Opin. Hematol.
5: 3–15;
Reise Sousa et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11: 392–399). Diese
dendritischen Zellen sind auf Grund ihrer Fähigkeit, eine Immunotoleranz
zu induzieren, auch dann ein vorteilhaftes Ziel, wenn es erwünscht ist,
die Immunantwort eines Patienten zu inhibieren, insbesondere, um
Autoimmunerkrankungen oder entzündliche
Krankheiten zu bekämpfen.
-
Reife
dendritische Zellen können
in vitro aus Monozyen in Kultur gewonnen werden. Diese Monozyten sind
in vivo zirkulierende Zellen, die, wenn sie insbesondere Gefäßendothelwände passieren,
in Kontakt mit umgebenden Faktoren kommen, die deren Entwicklung
auf eine Art und Weise beeinflussen, die immer noch schlecht verstanden
wird. Schematisch gesehen bestehen dann für diese Monozyten drei Möglichkeiten
- • sie
verlassen die Gewebe und kehren in die Lymphknoten zurück,
- • sie
differenzieren in Makrophagen,
- • sie
differenzieren in unreife dendritische Zellen.
-
Der
erste Schritt zur Gewinnung von reifen dendritischen Zellen aus
Monozyten in Kultur besteht dann in der Induzierung der Differenzierung
der Monozyten in unreife dendritische Zellen mit insbesondere Interleukin
IL-4 und dem Faktor GM-CSF
(Granulozyten-Makrophagen-stimulierender Faktor). Nach 6 Tagen sind
95% der Zellen in Kultur unreife dendritische Zellen.
-
Der
zweite Schritt besteht dann aus der Induzierung der Reifung der
unreifen dendritischen Zellen in reife dendritische Zellen, und
zwar durch exogene Stoffe, wie beispielsweise bakterielle oder virale
Stoffe. Auf diese Weise ist das KpOmpA-Protein aus Klebsiella pneumoniae
dazu in der Lage, die Reifung dieser unreifen dendritischen Zellen
in reife dendritische Zellen zu induzieren (P. Jeannin et al., Nature
Immunology, 2000, 1: 502–509).
Erwähnt
werden kann auch die Reifung der unreifen dendritischen Zellen in
reife dendritische Zellen durch andere exogene Moleküle, wie
beispielsweise bakterielle Membranlipopolysaccharide (Dichman et
al., Journal of Cellular Physiology, 2000, 185: 394–400). Die
Verwendung exogener Moleküle,
die von infektiösen Stoffen
abgeleitet sind, führt
jedoch zu Problemen hinsichtlich der Sicherheit und den Kosten (direkte
oder indirekte Nebenwirkungen in vivo; äußerste Notwendigkeit zur Reinigung
gemäß sehr strengen
rechtlichen oder regulatorischen Vorschriften, etc.), wodurch die
Verwendung dieser Arten Moleküle
im Kontext der Impfung und Immunotherapie schwierig wird.
-
Kürzlich wurde
von Perrin-Cocon et al., im Jahr 2001 beschrieben (Journal of Immunology,
167: 3785–3791),
dass die Produktion reifer dendritischer Zellen aus Monozyten, die
eine Differenzierung unterlaufen, mit endogenen Molekülen induziert
werden kann, wie beispielsweise mit bestimmten oxidierten Plasmalipoproteinen,
und noch genauer mit oxidierten „low density" Lipoproteinen (LDLs).
Jedoch stellen die oxidierten LDLs komplexe Partikel dar, die aus
Proteinen, Triacylglycerolen, Phospholipiden und freiem und verestertem Cholesterin
bestehen, und sind daher nur schwer künstlich zu synthetisieren.
-
Mit
der vorliegenden Erfindung sollen daher die Nachteile des Standes
der Technik überwunden
werden, und zwar durch Bereitstellung eines proinflammatorischen
Moleküls,
einem endogenen Molekül,
das einfach zu synthetisieren und relativ kostengünstig ist,
und welches die Differenzierung der Monozyten in reife dendritische
Zellen stimuliert.
-
Überraschenderweise
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von L-α-Lysophosphatidylcholin
zur Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen in
vitro.
-
Der
Ausdruck „L-α-Lysophosphatidylcholin" soll vorliegend
ein Molekül
bedeuten, welches die folgende Formel aufweist:
in welcher
eine
lange Kette gesättigter
Fettsäuren
mit von 12 bis 20 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise von 16 bis 18,
darstellt.
-
Tatsächlich ist
eines der aktiven Moleküle,
die während
der LDL-Oxidierung generiert werden, L-α-Lysophosphatidylcholin, das
nachstehend als LPC bezeichnet wird. Es konnte jedoch gezeigt werden,
dass die Bindung von LPC an den G2A-Rezeptor, der ein Rezeptor mit hoher
Affinität
für LPC
ist, insbesondere die Proliferation und Aktivierung der T-Lymphozyten
inhibiert, was vielmehr eine Rolle des LPC bei der Inhibierung der Auslösung einer
Immunreaktion nahelegt (Carson & Lo,
2001, Science, 293: 618–619).
Darüber
hinaus konnte auch gezeigt werden, dass eine hohe LPC-Konzentration
(50 μM)
die Aktivität
des Transkriptionsfaktors NF-κB (nucleärer Faktor κB) inhibiert,
von welchem jedoch bekannt ist, dass er während der Reifung der dendritischen Zellen
aktiviert wird. Darüber
hinaus liegt LPC im Plasma in hohen Konzentrationen vor, was nahelegt,
dass es im Plasma nicht aktiv ist, wodurch es von den Fachleuten
für eine
therapeutische Verwendung nicht in Betracht gezogen würde.
-
Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vitro-Differenzierung von
Monozyten in reife dendritische Zellen, wonach:
- A.
Monozyten in einem geeigneten Kulturmedium bereitgestellt werden,
- B. die Differenzierung der Monozyten in dendritische Zellen
in Gegenwart eines Differenzierungsfaktors induziert wird,
- C. L-α-Lysophosphatidylcholin
zu dem Medium hinzugefügt
wird und reife dendritische Zellen gewonnen werden.
-
Der
Ausdruck „geeignetes
Kulturmedium" soll
vorliegend ein Medium bedeuten, welches alle Elemente aufweist,
die für
die Zelllebensfähigkeit
benötigt
werden. Als Beispiel kann das Medium RPMI 1640 und dessen Derivate
erwähnt
werden, sowie jedes andere Kulturmedium, das den Fachleuten hinreichend
bekannt ist. Das Medium weist insbesondere mindestens einen Faktor
zur Differenzierung der Monozyten in dendritische Zellen auf. Die
Faktoren zur Differenzierung von Monozyten in dendritische Zellen
sind den Fachleuten gut bekannt, insbesondere können Cytokine, wie beispielsweise – ohne jedoch
begrenzend zu sein – die
Interleukine IL-4, der Faktor GM-CFS (Granulozyten-Makrophagen-stimulierender
Faktor), IL-13 oder TNF (Tumornekrosefaktor) erwähnt werden.
-
In
Schritt C) wird L-α-Lysophosphatidylcholin
zu dem Medium insbesondere mit einer Endkonzentration im Medium
zwischen ca. 10 und 80 μM,
vorzugsweise zwischen ungefähr
20 und 60 μM,
und vorzugsweise zwischen 30 und 50 μM hinzugefügt. Ferner wird in Schritt
C) L-α-Lysophosphatidylcholin
zu dem Medium zwischen dem dritten und dem sechsten Tag der Monozyten-Differenzierung
hinzuge fügt,
vorzugsweise zwischen dem vierten und fünften Tag der Monozytendifferenzierung.
-
Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
der Erfindung wird zu dem Kulturmedium in Schritt C) mindestens
ein Antigen, wie beispielsweise ein Molekül (oder mehrere Moleküle), das
das Ziel einer Immunantwort ist, oder welches die Synthese dieses
Ziels ermöglicht,
hinzugefügt.
Dieses Antigen kann aus bakteriellen, viralen, Hefe-, parasitären oder
Pilz-Antigenen ausgewählt
werden, ferner aus Tumorantigenen und aus Lysaten autologer und/oder
heterologer Tumorzellen. Der Ausdruck „autologe Tumorzellen" soll vorliegend
Tumorzellen bedeuten, die einem Individuum zugerechnet werden, der
ein bestimmtes Arzneimittel einnimmt. Die Tumorzellen können durch
Entnahme einer Probe von Krebsgewebe gewonnen werden, insbesondere
durch eine Biopsie oder eine chirurgische Resektion. Der Ausdruck „heterologe
Tumorzellen" soll
vorliegend Zellen bedeuten, die aus Tumoren abgeleitet sind, die
aus einem Individuum herrühren,
das sich von demjenigen unterscheidet, der ein bestimmtes Arzneimittel
einnimmt. Die Verwendung von heterologen Zellen ermöglicht es insbesondere,
ein Arzneimittel zur Behandlung von Patienten zu erhalten, die an
Krebs leiden, und bei welchen es nicht möglich ist, eine Tumorzellprobe
zu gewinnen. Dies ermöglicht
es auch, eine Standardquelle von Tumorantigenen zu verwenden. Der
Ausdruck „Zelllysat" soll vorliegend
eine Mischung zellulärer
und/oder Membranantigene bedeuten, die durch die Lyse der Zellen
gemäß einem,
den Fachleuten bekannten Protokoll gewonnen wurden, wie beispielsweise
durch eine mechanische, chemische oder enzymatische Lyse. Dieses
Antigen kann auch eine Nucleinsäure
sein, die zumindest für
ein Antigen codiert, das aus bakteriellen, viralen, Hefe-, parasitären oder
Pilz-Antigenen sowie Tumorantigenen ausgewählt ist. Der Ausdruck „Tumorantigene" soll vorliegend
ein Antigen bedeuten, das aus Tumorzellen abgeleitet ist, wie beispielsweise
ein Tumor-bezogenes Peptid, insbesondere ein Peptid, das mit Klasse
I-Molekülen
wechselwirkt, und das CD8-T-Lymphozyten präsentiert wird. Erwähnt werden
können
ferner – wiederum
ohne einschränkend
zu sein – die
folgenden Tumorantigene: MAGE-2, MAGE-3, MART, MUC-1, MUC-2, HER-2,
GD2, das carcinoembryogene Antigen (CEA), TAG-72, die Eierstock-assoziierten Antigene
OV-TL3 und MOV18, TUAN, alpha- Fetoprotein
(AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA-19-9, das Nierentumor-assoziierte
Antigen G250, EGP-40 (oder EpCAM), S100 (malignes Melanom-assoziiertes
Antigen), p53, Prostatakrebs-assoziierte Antigene (beispielsweise
PSA und PSMA) und p21ras.
-
Daher
ermöglicht
es die Hinzufügung
dieses Antigens zu dem Kulturmedium, reife dendritische Zellen zu
erhalten, welche wiederum die Aktivierung der T-Lymphozyten ermöglichen,
die gegen ein bestimmtes Antigen gerichtet sind. Diese reifen dendritischen
Zellen, die in vitro gewonnen werden, können anschließend in vivo
injiziert werden. Darüber
hinaus ist es möglich,
in Schritt C) eine Verbindung zu verwenden, die äquivalent zu L-α-Lysophosphatidylcholin
ist, also ein Molekül,
das gemäß den gleichen
zellulären
Wirkungsmechanismen wie L-α-Lysophosphatidylcholin
wirkt, das heißt, über die
gleichen Membranrezeptoren, insbesondere über G-Protein-gekoppelte Membranrezeptoren,
wie beispielsweise die Rezeptoren G2A, GPR4 oder der PAF (plättchenaktivierender
Faktor)-Rezeptor und/oder über
die gleichen nucleären
Rezeptoren, wie beispielsweise die PPAR-Rezeptoren (Peroxisom-Proliferations-aktivierter
Rezeptor). Diese äquivalente
Verbindung kann daher insbesondere ein Agonist für die oben erwähnten Rezeptoren
sein (wie beispielsweise insbesondere O-Methyl-PAF, Carbamyl-PAF
oder 2-O-Methyl-PAF), jedoch auch PAF selbst. Diese Verbindung kann
ferner auch ein PPARδ-Agonist
sein, wie beispielsweise insbesondere L165041 (Merck Research),
GW-501516 (Glaxo), Carboprostacyclin (Cayman) oder ein PPARγ-Antagonist,
wie beispielsweise insbesondere Bisphenol-A-Diglycidylethyl (Sigma) oder Diclofenac®.
Die L-α-Lysophosphatidylcholin-äquivalente
Verbindung kann alleine verwendet werden, oder aber zusammen mit
L-α-Lysophosphatidylcholin.
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird das L-α-Lysophosphatidylcholin
zusammen mit dem plättchenaktivierenden
Faktor (PAF) verwendet.
-
Die
Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur in vitro-Aktivierung
von T-Lymphozyten,
bei welchem:
- A. Monozyten in einem geeigneten
Kulturmedium bereitgestellt werden,
- B. die Differenzierung der Monozyten in dendritische Zellen
in Gegenwart eines Differenzierungsfaktors induziert wird,
- C. L-α-Lysophosphatidylcholin
zu dem Medium hinzugefügt
wird und reife dendritische Zellen erhalten werden,
- D. ein wie oben definiertes Antigen zu dem Medium hinzugefügt wird
und die in Schritt B erhaltenen reifen dendritischen Zellen werden
gegen das Antigen gerichtet,
- E. die reifen dendritischen Zellen, die gemäß Schritt C gegen das Antigen
gerichtet sind, werden mit T-Lymphozyten in Kontakt gebracht, und
T-Lymphozyten, die
gegen das Antigen gerichtet sind, werden erhalten,
-
Schritt
C) kann wie oben beschrieben ausgeführt werden. Ein solches Verfahren
ermöglicht
es daher, T-Lymphozyten, die gegen einen bestimmten biologischen
Stoff gerichtet sind, in vitro zu gewinnen, die anschließend in
einen Patienten in vivo injiziert werden können, insbesondere einem immunsupprimierten
Patienten.
-
Die
Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Reifung von dendritischen
Zellen in vitro, bei welchem:
- A. unreife dendritische
Zellen in einem geeigneten Kulturmedium bereitgestellt werden,
- B. L-α-Lysophosphatidylcholin
zu dem Medium hinzugefügt
wird und reife dendritische Zellen gewonnen werden.
-
Den
Fachleuten sind dendritische Zellen und deren verschiedene Reifungsstadien
hinreichend bekannt.
-
In
Schritt B) wird L-α-Lysophosphatidylcholin
zu dem Medium insbesondere mit einer Endkonzentration im Medium
von zwischen ungefähr
10 und 80 μM
hinzugefügt,
vorzugsweise zwischen ungefähr
20 und 60 μM
und vorzugsweise zwischen 30 und 50 μM. Gemäß einer besonderen Ausführungsform
wird zumindest ein wie oben definierter biologischer Stoff ebenfalls
zu dem Kulturmedium in Schritt B) hinzugefügt.
-
Die
Erfindung betrifft ferner ein Kulturmedium, das darin gekennzeichnet
ist, dass es L-α-Lysophosphatidylcholin
mit einer Endkonzentration von zwischen ungefähr 10 und 80 μM, vorzugsweise
zwischen ungefähr
20 und 60 μM
und vorzugsweise zwischen 30 und 50 μM aufweist, sowie mindestens
einen wie oben definierten Differenzierungsfaktor.
-
Gemäß einer
besonderen Ausführungsform
der Erfindung weist das Kulturmedium ferner ein wie oben definiertes
Antigen auf, das insbesondere ein bakterielles, virales, Hefe-,
parasitäres
oder Pilz-Antigen ist, ein autologes und/oder heterologes Tumorzelllysat-Antigen,
ein Tumorantigen, eine Nucleinsäure,
die für
ein bakterielles, virales, Hefe-, parasitäres oder Pilz-Antigen codiert,
oder aber eine Nucleinsäure,
die für
ein Tumorantigen codiert.
-
Die
Erfindung betrifft ferner die Verwendung von L-α-Lysophosphatidylcholin als
Mittel zur Aktivierung des Immunsystems. Der Ausdruck „Mittel
zur Aktivierung" soll
vorliegend ein Molekül
bedeuten, das in einer pharmazeutischen Zusammensetzung die Effekte
eines Medikaments induziert, oder aber das die Effekte des Hauptmedikaments
verstärkt
oder komplettiert. Im Falle einer Impfzusammensetzung spielt L-α-Lysophosphatidylcholin
dann die Rolle eines Adjuvans, das die Immunantwort des Wirtsorganismus
gegen ein bestimmtes Antigen stimuliert. Daher betrifft die Erfindung
auch eine Impfzusammensetzung, die dadurch charakterisiert ist,
dass sie L-α-Lysophosphatidylcholin
als Mittel zur Aktivierung des Immunsystems aufweist, welches dann die
Rolle eines Adjuvans spielt, und ferner ein wie oben definiertes
Antigen, gegen welches die Immunantwort des Patienten stimuliert
werden soll.
-
Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung wird L-α-Lysophosphatidylcholin
als Mittel zur Aktivierung des Immunsystems verwendet, zur Herstellung
eines Arzneimittels für
die Behandlung und/oder die Prävention
einer bakte riellen, viralen, Pilz- oder parasitären Infektion, oder aber einer
Infektion, die durch eine Hefe verursacht wird, und/oder für die Herstellung
eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder der Prävention
von Krebs.
-
Als
Beispiel für
eine bakterielle Infektion können
insbesondere Infektionen erwähnt
werden, die durch Staphylococcen, Mycobakterien, Bakterien des Genus
Neisseria, durch Legionellen, Salmonellen etc. hervorgerufen werden.
-
Als
Beispiel für
eine virale Infektion können
insbesondere Infektionen erwähnt
werden, die durch HIV (human immunodeficiency virus), Hepatitisviren,
das Masernvirus, das Rötelnvirus,
das Poliovirus, das Flavi-Virus etc. hervorgerufen werden.
-
Als
Beispiele für
eine Pilzinfektion können
insbesondere die Aspergillose, Candidose etc. erwähnt werden.
-
Als
parasitische Infektion kann insbesondere Malaria, Leishmaniose etc.
erwähnt
werden.
-
Der
Ausdruck „Krebs" soll vorliegend
alle Krankheiten bedeuten, die auf eine abnormale Vervielfältigung
von Zellen zurückzuführen ist,
und insbesondere – wiederum
nicht einschränkend
auf – Myelome,
Lymphome, Leukämien,
Nieren-, Gehirn-, Darm-, Prostata-, Rektal-, Bauchspeicheldrüsen-, Eierstock-,
Lungen-, Leber- und
Brustkarzinome, Hautkrebs, ausgewählt aus Keratinomen und Karzinomen,
sowie Melanome.
-
Das
Arzneimittel gemäß der Erfindung
kann in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung in Kombination
mit zumindest einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger bereitgestellt
werden, die den Fachleuten hinreichend bekannt sind. In den pharmazeutischen
Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden
Erfindung kann für
eine orale, sublinguale, subkutane, intramuskuläre, intravenöse, topische, intratracheale,
rektale oder transdermale Verabreichung das L-α-Lysophosphatidylcholin in einer
Einheitsdosierungsform oder als eine Mischung mit herkömmlichen
pharmazeutischen Trägern
verabreicht werden, und kann beispielsweise – wenn eine orale Verabreichung
beabsichtigt ist – beispielsweise
in Form einer Tablette, einer Gelkapsel, einer oralen Lösung etc.
vorliegen, oder für
eine rektale Verabreichung in Form eines Zäpfchens, für eine parenterale Verabreichung
insbesondere in Form einer injizierbaren Lösung, beispielsweise für eine intravenöse, intradermale
oder subkutane Injektion, etc., und zwar gemäß herkömmlichen Vorschriften, die
den Fachleuten hinreichend bekannt sind. Für eine topische Auftragung
kann das L-α-Lysophosphatidylcholin
in Cremes, Salben, Lotionen oder Augenlotionen eingesetzt werden.
-
Für den Fall,
dass eine feste Zusammensetzung in Form von Tabletten hergestellt
wird, wird L-α-Lysophosphatidylcholin
mit einem pharmazeutisch akzeptierbaren Exzipienten gemischt, der
auch als pharmazeutisches „Vehikel" bezeichnet wird,
wie beispielsweise Gelatine, Stärke,
Lactose, Magnesiumstearat, Talk, Gummi Arabicum oder Ähnlichem.
Die Tabletten können
mit Sucrose, mit einem Zellulosederivat oder mit anderen geeigneten
Materialien beschichtet sein. Sie können ferner auch derart behandelt
sein, dass sie eine verlängerte
oder verzögerte
Aktivität
besitzen, und auch derart, dass sie eine vorbestimmte Menge des
L-α-Lysophosphatidylcholin
kontinuierlich freisetzen. Es ist auch möglich, ein Gelkapselpräparat zu
erhalten, in dem L-α-Lysophosphatidylcholin
mit einem Verdünnungsmittel
vermischt wird und die Mischung in weiche oder harte Gelkapseln
gegossen wird. Es ist auch möglich,
ein Präparat
in Form eines Sirups zu erhalten, oder aber zur Verabreichung in
Form von Tropfen, in welchen das L-α-Lysophosphatidylcholin mit
einem Süßungsmittel, einem
Antiseptikum, wie beispielsweise insbesondere Methylparaben und
Propylparaben vorliegt, und ferner einem geeigneten Geschmacksstoffverstärker oder
Farbstoff. Wasserdispergierbare Pulver oder Granulate können L-α-Lysophosphatidylcholin
als eine Mischung mit Dispersionsmitteln oder benetzenden Mitteln
enthalten, oder aber mit suspendierenden Mitteln, die den Fachleuten
hinreichend bekannt sind. Für
eine parenterale Verabreichung werden wässrige Suspensionen eingesetzt,
isotonische Salinelösungen
oder sterile und injizierbare Lösungen,
die Dispersions mittel oder benetzende Mittel enthalten, pharmakologisch
kompatibel sind, wie beispielsweise insbesondere Propylenglycol
oder Butylenglycol.
-
1 zeigt
den Titrationsverlauf, der die Absorption (Abs) als Funktion des
Logarithmus der Verdünnung
des Serums einer Gruppe von Mäusen
zeigt, denen LPC gemischt mit Hühnerei-Lysozym
(HEL, 1 mg/ml) oder HEL alleine verabreicht wurde.
-
Die
folgenden Beispiele dienen lediglich der Erläuterung und sollen in keiner
Weise einschränkend sein.
Anhand der Beispiele wird es möglich
sein, die Erfindung besser zu verstehen.
-
Beispiel 1 – Differenzierung
von Monozyten in Kultur in dendritische Zellen in Gegenwart oder
Abwesenheit von L-α-Lysophosphatidylcholin
(LPC)
-
Isolierung,
Platzierung in Kultur und Initiierung der Differenzierung der Monozyten – Die Monozyten werden
aus menschlichem peripheren Blut mittels einer ersten Dichtegradientenzentrifugation
(620 g; 20 Minuten) in Ficoll-Hypaque isoliert, worauf eine zweite
Zentrifugation (770 g; 20 Minuten) in einer 50% Percoll-Lösung folgt.
Anschließend
werden die Monozyten durch eine immunomagnetische Depletion (Dynal,
Oslo, Norwegen) gereinigt, und zwar unter Verwendung eines Cocktails
aus Anti-CD19 (Hybridom 4G7) (Becton Dickinson, Francklin Lakes,
NJ, USA), Anti-CD3 (OKT3, American Type Culture Collection, Rockeville,
MD) und Anti-CD56 (NKH1, Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) monoklonalen
Antikörpern.
Die auf diese Weise erhaltenen Monozyten werden anschließend auf
mindestens 90% gereinigt, wie durch die Abwesenheit der CD1A-Marker
und das Vorliegen des CD14-Markers bestätigt wurde. Die Differenzierung
der Monozyten in dendritische Zellen wird mit 40 ng/ml des rekombinanten
humanen GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor) und 250
U/ml an rekombinantem menschlichen Interleukin IL-4 gestartet.
-
Die
Monozyten werden in Kultur in RPMI 1640-Medium gegeben (Life Technologies,
Rockeville, MD, USA), das mit 2 mM Glutamin (Life Technologies),
10 mM Hepes (Life Technologies), 40 ng/ml Gentamycin (Life Technologies)
und 10% eines Lipoprotein-depletierten fötalen Kälberserums (LPDS, Sigma, St.
Quentin-Fallavier, Frankreich) angereichert ist.
-
Es
sollte erwähnt
werden, dass das in diesem Beispiel verwendete Kulturmedium ein
LPDS-Kulturmedium ist. Vergleichbare Ergebnisse können unter
Verwendung anderer Kulturmedien gewonnen werden, wie beispielsweise
einem FCS-Medium, das heißt,
einem Medium mit 10% nicht-Lipoprotein-depletiertem fötalem Kälberserum;
vergleichbare Ergebnisse könnten
auch unter Verwendung irgendeines synthetischen Kulturmediums erhalten
werden, das den Fachleuten bekannt ist.
-
Behandlung
der Monozyten mit LPC – 5
Tage nach Start der Differenzierung der Monozyten wurde 40 μM LPC (L-α-Lysophosphatidylcholin;
Sigma, St. Quentin-Fallavier,
Frankreich) zu dem Kulturmedium über
24 Stunden hinzugefügt.
Ferner wurden Kontrollzellen in Abwesenheit von LPC in Kulturmedium
gewonnen.
-
„Kontroll"-Zellen und „LPC"-Zellen wurden anschließend erhalten.
-
Beispiel 2 – Phänotyp der
gemäß Beispiel
1 gewonnenen Zellen
-
Die
in dieser Analyse verwendeten Zellen sind diejenigen, die am 6.
Tag der Differenzierung gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Protokoll gewonnen wurden.
-
Der
Phänotyp
der „Kontroll"- und „LPC"-Zellen wird durch
Flusszytometrie auf einem FACS Calibur (Becton Dickinson, Francklin
Lakes, NJ, USA) unter Verwendung von FITC(Fluoresceinisothiocyanat)-konjugiertem
Anti-CD14, Anti-HLA-DR, Anti-CD80 und PE (Phycoerythrin)-konjugiertem
Anti-CD1a, Anti-CD83, Anti-CD86 und Anti-CD40 (Beckman Coulter)
analysiert. Gemäß dem Stand
der Technik haben Monozyten vorzugsweise einen CD14+CD1a–-Phänotyp, unreife
dendritische Zellen haben vorzugsweise einen CD14+CD1a+CD86–-Phänotyp und reife dendritische
Zellen haben vorzugsweise einen CD14–CD1a-intermediären-CD86+-Phänotyp.
-
Die
erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE
1 – Expression
der CD83-, HLA-DR- und CD86-Marker in Abwesenheit (Kontrolle) oder
in Gegenwart von LPC
-
Die „LPC"-Zellen, die nach
Initiierung der Differenzierung der Monozyten in Gegenwart von LPC
gewonnen wurden, zeigen einen Phänotyp,
der zu demjenigen von reifen dendritischen Zellen vergleichbar ist, wie
insbesondere durch die Induktion der CD86-Marker und dem Anstieg
in HLA-DR gezeigt wurde, verglichen zum Phänotyp der „Kontroll"-Zellen.
-
Beispiel 3 – Internalisierungs-Fähigkeit
der gemäß Beispiel
1 gewonnen Zellen
-
Die „Kontroll"- und „LPC"-Zellen, die in dieser
Analyse verwendet wurden, sind diejenigen, die nach 6 Tagen der
Differenzierung gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Protokoll gewonnen wurden. Diese Zellen werden
bei 37°C
inkubiert:
- • 30
Minuten mit 1 mg/ml FITC-T70-Dextran (Sigma), um die Fähigkeit
dieser Zellen, durch Endozytose zu internalisieren, einzuschätzen,
- • 30
Minuten mit 1 mg/ml Lucifer-Gelb (Ref. L0259, Sigma, St. Quentin-Fallavier, Frankreich),
um die Fähigkeit
dieser Zellen, durch Pinozytose zu internalisieren, einzuschätzen,
- • 3
Stunden mit Carboxylat-modifiziertem, gelb-grünem FluoSperen (Handelsname,
0,45 μm,
Molecular Probes, Leiden, Niederlande), um die Fähigkeit dieser Zellen, durch
Makropinozytose zu internalisieren, einzuschätzen.
-
Die
Internalisierung wird auf Eis mit einem kalten PBS-Puffer gestoppt,
der 0,1% BSA (Rinderserumalbumin) und 0,05% NaN3 enthielt.
Die „Kontroll"- und „LPC"-Zellen werden dreimal
bei 4°C
in diesem gleichen Puffer gewaschen und die Fluoreszenz mittels
FACS Calibur (Handelsname, Becton Dickinson) quantifiziert.
-
Wie
in Tabelle 2 gezeigt, werden die Fähigkeiten für die Internalisierung durch
Endozytose, Pinozytose und Makropinozytose durch das Hinzufügen des
LPC zu dem Kulturmedium am 5. Tag der Differenzierung der Monozyten
stark gesenkt, im Vergleich zu den Kontrollzellen, die in Abwesenheit
des LPC differenzierten. TABELLE
2 – Fähigkeit
zur Internalisierung durch Endozytose, Pinozytose und Makropinozytose
der Monozyten, die in Abwesenheit (Kontrolle) oder in Gegenwart
des LPC differenzierten
- Das Absenken in den Fähigkeiten zur Internalisierung
ist eine der Eigenschaften von reifen dendritischen Zellen. Diese
Ergebnisse zeigen, dass in Gegenwart des LPC die Monozyten eine
starke Tendenz besitzen, in reife dendritische Zellen zu differenzieren.
-
Beispiel 4 – Fähigkeit
der gemäß Beispiel
1 gewonnenen Zellen, T-Lymphozyten zu stimulieren
-
Die „Kontroll"- und „LPC"-Zellen, die bei
dieser Analyse verwendet wurden, sind diejenigen, die nach 6 Tagen
Differenzierung gemäß dem in
Beispiel 1 beschriebenen Protokoll gewonnen wurden.
-
Native
allogene T-Lymphozyten werden aus menschlichem peripherem Blut isoliert.
Periphere Blut-mononucleäre
Zellen werden mittels Dichtegradientenzentrifugation (600 g, 20
Minuten) mit Ficoll-Hypaque isoliert. Nach Eliminierung der Monozyten
auf einem Percoll-Gradienten werden die peripheren Blutlymphozyten
in der dichten Fraktion gefunden. Die T-Lymphozyten werden durch
immunomagnetische Depletion unter Verwendung einer Mischung aus
Anti-CD19 (Antikörper
4G7) (Becton Dickinson, Francklin Lakes, NJ, USA), Anti-CD16 (Antikörper 3G8),
Anti-CD56 (Antikörper NKH1),
Antiglycophorin A (Antikörper
11E4B7.6) und Anti-CD14 (Antikörper
RMPO52) monoklonalen Antikörpern
identifiziert, die von Beckman Coulter käuflich erworben wurden.
-
Die
gereinigten T-Lymphozyten werden in flachen 96-Well-Kulturplatten
entweder mit „Kontroll"- oder „LPC"-Zellen kultiviert.
-
2 × 105 T-Zellen werden in 200 μl Kulturmedium mit einem Verhältnis von
1:5, 1:10 oder 1:20 differenzierte Monozyten in Gegenwart oder Abwesenheit
von LPC/T-Zellen
kultiviert (Verhältnis
DC/LT). Nach 4 Tagen wurden 50 μl
des Kulturüberstands
dazu eingesetzt, um die Sekretion von IL-2 (Interleukin 2) und von
IFNλ (Interferon
Gamma) unter Verwendung eines ELISA-Kits (Endogen, Woburn, MA, USA)
zu bestimmen.
-
Wie
in Tabelle 3 gezeigt, wird die Sekretion von IL2 und von IFNλ durch T-Lymphozyten, die
gewöhnlich
mit dem Verhältnis
der dendritischen Zellen/T-Lymphozyten
(DC/LT-Verhältnis)
ausgedrückt
wird, durch die Zellen stark stimuliert, die aus der Differenzierung
der Monozyten in Gegenwart des LPC herrühren, das 5 Tage nach der Initiierung
der Monozytendifferenzierung („LPC"-Zellen) hinzugefügt wurde,
im Vergleich zu den Kontrollergebnissen („Kontroll"-Zellen). TABELLE
3 – Stimulation
der Sekretion von IL2 und von IFNγ durch
T-Lymphozyten, induziert durch die in Abwesenheit (Kontrolle) oder
in Gegenwart von LPC differenzierten Monozyten
- Diese Ergebnisse zeigen einen Anstieg in
den Fähigkeiten
der Monozyten, die in Gegenwart des LPC differenzierten, allogene
T-Lymphozyten zu stimulieren, was eine Eigenschaft reifer dendritischer
Zellen darstellt. Vergleichbare Ergebnisse wurden erhalten, wenn
LPC in Ethanol gelöst
wird, oder in Form einer Lipidemulsion vorlag.
-
Beispiel 5 – Eigenschaften
der gemäß Beispiel
1 gewonnenen Zellen: Vergleich mit reifen dendritischen Zellen, die
durch Differenzierung der Monozyten in Gegenwart von oxidierten
LDLs gewonnen wurden
-
Das
Ziel dieses Beispiels ist es zu zeigen, dass der Wirkungsmechanismus,
der bei der Differenzierung der Monozyten in reife dendritische
Zellen in Gegenwart von LPC beteiligt ist, unterschiedlich zu demjenigen
sein könnte,
der bei der Differenzierung von Monozyten in reife dendritische
Zellen in Gegenwart von oxidierten LDLs beteiligt ist (Perrin-Cocon
et al., The Journal of Immunology, 167: 3785–3891, 2001).
-
In
diesem Beispiel werden die als „Kontroll"- und „LPC"-Zellen bezeichneten Zellen, die in
Beispiel 1 gewonnen wurden, verwendet und ferner „LDLox"-Zellen, die wie
in der wissenschaftlichen Veröffentlichung (Perrin-Cocon
et al., The Journal of Immunology, 167: 3785–3891, 2001) beschrieben, gewonnen
wurden, das heißt,
nach Differenzierung der Monozyten in Kultur in Gegenwart von oxidierten
LDLs, die 5 Tage nach der Initiierung der Differenzierung zu dem
Medium hinzugefügt
wurden.
-
Die
Erfinder untersuchten, ob die Inhibitoren der Wirkung von oxidierten
LDLs auf die Differenzierung von Monozyten in reife dendritische
Zellen auch die Wirkung von LPC auf die Differenzierung von Monozyten in
reife dendritische Zellen inhibierte.
-
Aus
diesen Gründen
wurde eine Lösung
aus Intralipid
® (50 μg/ml Phospholipide,
Fresenius Kabi, Sèvres,
Frankreich) oder eine Lösung
aus synthetischen Molekülen
mit Lipid-Eigenschaft (Lipoïd
E-80
®,
Lipoïd AG,
Ludwigshafen, Deutschland, 50 μg/ml
Phospholipide), zu dem Kulturmedium am 5. Tag der Differenzierung
hinzugefügt.
Die Expression von CD86 durch die „LPC"- und „LDLox"-Zellen in Gegenwart dieser Inhibitoren
wird gemäß dem in
Beispiel 2 beschriebenen Protokoll analysiert und die Ergebnisse
sind in Tabelle 4 wiedergegeben. TABELLE
4 – Inhibierung
(in %) der Expression von CD86 durch LPC- und LDLox-Zellen durch Intralipid
® und Lipoïd E-80
- Die Hinzufügung von Intralipid® inhibiert
die Differenzierung der Monozyten in reife dendritische Zellen durch die
oxidierten LDLs und durch LPC auf eine vergleichbare Art und Weise
(Inhibierung bei etwa 80%).
-
Auf
der anderen Seite induziert überraschenderweise
die Hinzufügung
des Lipoids E-80 eine 81%ige Inhibierung der CD86-Expression, wenn
die Monozyten in Gegenwart der oxidierten LDLs kultiviert werden, obgleich
diese Inhibierung lediglich 24% beträgt, wenn die Monozyten in Gegenwart
von LPC kultiviert werden.
-
Diese
Ergebnisse legen nahe, dass der Wirkungsmechanismus des LPC hinsichtlich
der Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen unterschiedlich
zu dem Wirkungsmechanismus von oxidierten LDLs ist.
-
Beispiel 6 – Zelluläre Mechanismen,
die bei der Differenzierung der Monozyten in reife dendritische
Zellen in Gegenwart von LPC beteiligt sind.
-
Um
bei der Suche nach den zellulären
Wirkungsmechanismen von LPC bei der Differenzierung von Monozyten
in reife dendritische Zellen weiterzukommen, untersuchten die Erfinder,
welche der Rezeptoren beteiligt sein könnten.
-
Um
zunächst
zu bestimmen, ob die bei der Wirkung von LPC auf die Differenzierung
der Monozyten in reife dendritische Zellen beteiligten Rezeptoren
zu der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehörten, wurde
PTX (Pertussistoxin; 100 ng/ml), von dem bekannt ist, dass es Gi-Proteine
blockiert, zu dem Kulturmedium für
3 Stunden hinzugefügt.
Das Kulturmedium wurde anschließend
ausgetauscht und das LPC, wie in Beispiel 1 beschrieben, hinzugefügt.
-
Die
in der Tabelle 5 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, dass die Vorinkubation
der Monozyten mit PTX den durch LPC induzierten Anstieg in CD86
blockiert, was nahelegt, dass bei der Wirkung des LPC Gi-Protein-gekoppelte
Rezeptoren beteiligt sind. TABELLE
5 – Inhibition
der Expression von CD86 durch die „LPC"-Zellen durch PTX
-
Diese
Rezeptoren könnten
insbesondere die folgenden Rezeptoren sein:
- • G2A-Rezeptor
(G2A-R): erst kürzlich
wurde gezeigt, dass LPC ein Ligand mit hoher Affinität für das G2A-Protein
ist, welches ein G-Protein ist, das an einen Rezeptor gekoppelt
ist, der in Lymphozyten exprimiert wird. Darüber hinaus induziert die Stimulierung
von G2A durch LPC die Phosphorylierung einer extrazellulären Kinase
(ERK1/2: extrazelluläre
Signal-bezogene Kinasen). Diese Phosphorylierung kann darüber hinaus
auch dann beobachtet werden, wenn LPC zu dem Kulturmedium hinzugefügt wird,
was die Beteiligung des G2A-Rezeptors bei der Differenzierung der
Monozyten in reife dendritische Zellen durch das LPC nahelegt,
- • PAF-Rezeptor
(PAF-R), wie oben beschrieben: bestimmte Effekte des LPC könnten die
Beteiligung des PAF-Rezeptors bei verschiedenen Zelltypen implizieren,
- • GPR4-Rezeptor:
LPC ist auch ein Ligand für
das GPR4-Protein, das ein anderes G-Protein darstellt, welches an
einen Rezeptor gekoppelt ist, der eine hohe Affinität für Sphingosylphosphorylcholin
besitzt.
-
In
einem nächsten
Schritt untersuchten die Erfinder die Transkriptionsfaktoren, die
bei dem durch LPC induzierten Reifungsprozess beteiligt sind. Um
zu bestimmen, ob PPARs bei der LPC-induzierten Reifung beteiligt
sind, wurde die Bindungsfähigkeit
der beiden Transkriptionsfaktoren PPARγ und PPARδ untersucht, und zwar unter
Verwendung der Gelshifttechnik. 3 Isotypen der nucleären PPAR-Rezeptoren (Peroxisom-Proliferator-aktivierter
Rezeptor) existieren: α, γ und δ. PPARγs stellen
die Ziele für
Moleküle
der Thiazolidindion-Klasse dar, wie beispielsweise. Ciglitazon,
das bei der Behandlung von Typ II-Diabetes eingesetzt wird. PPARδs werden
stärker
exprimiert und können
PPARγs reprimieren.
Die Monozyten, die eine Differenzierung untergehen, werden zwei
Stunden mit einer Lösung
von LPC (40 μM)
(„LPC"-Zellen) inkubiert.
Die „Kontroll"-Zellen werden ebenfalls
in Abwesenheit des LPC in Kulturmedium gewonnen. Nach Abernten der
Zellen werden die nucleä ren
Proteine mit dem Nuclear Extract Kit (Sigma) extrahiert. Anschließend wurden
die nucleären
Proteine mit einer radioaktiv markierten Sonde in Kontakt gebracht,
die ein von den PPARs erkanntes „response"-Element enthielten. Nach dem Wandern
durch ein nicht-denaturierendes Gel wurde eine Bande, die PPARγ enthielt
und eine doppelte Bande, die PPARδ enthielt
unter Verwendung von Antikörpern
durch die Supershifttechnik identifiziert. Die Bindungsaktivität von PPAR
wurde durch Messung der Intensität
dieser Banden bestimmt. Diese Aktivitäten werden als Prozentsatz
hinsichtlich der Kontrollzellen ausgedrückt. Tabelle
6 – Modulation
der Aktivität
von PPARγ und
PPARδ durch
LPC
- Die Behandlung mit LPC induziert ein starkes
Absenken in der Bindungsaktivität
von PPARγ,
was zu einem vollständigen
Verschwinden führen
kann, und stimuliert die Aktivität
von PPARδ stark.
-
Anschließend verwendeten
die Erfinder einen PPARγ-Agonisten,
nämlich
Ciglitazon. Eine Lösung
an Ciglitazon (Sigma, 50 μM)
wurde am 5. Tag der Monozytendifferenzierung zu dem Kulturmedium
hinzugefügt, wie
in Beispiel 1 beschrieben, und zwar 15 Minuten vor Hinzufügung einer
LPC-Lösung
(40 μM für 2 Stunden). Die
gewonnenen Zellen werden als „LPC
+ Ciglitazon"-Zellen
bezeichnet. „Ciglitazon"-Zellen wurden nach dem gleichen Protokoll
erhalten, jedoch in Abwesenheit von LPC, und „LPC"-Zellen wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben,
erhalten, in Abwesenheit von Ciglitazon.
-
Die
Aktivität
der PPARγ-
und PPARδ-Transkriptionsfaktoren
wurde in diesen Zellen mittels der Gelshifttechnik wie oben beschrieben
gemessen. Tabelle
7 – Ciglitazon
blockiert die Inaktivierung von PPARγ und reduziert den LPC-induzierten Anstieg
in PPARδ
- Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass
Ciglitazon, das PPARγ aktiviert,
den Effekt von LPC auf PPARγ und PPARδ stark inhibiert,
und dass es als Ergebnis die LPC-induzierte
Reifung der dendritischen Zellen blockiert.
-
Die
funktionelle Fähigkeit
dieser Zellen („Kontrolle"-, „Ciglitazon"- und „LPC +
Ciglitazon"-Zellen) T-Lymphozyten
(LT) zu stimulieren, wurde anschließend untersucht. Diese Zellen
wurden, wie in Beispiel 4 beschrieben, kultiviert, in Gegenwart
von gereinigten allogenen 7-Lymphozyten. Die Sekretion von IFNγ wurde, wie
in Beispiel 4 beschrieben, gemessen. Tabelle
8 – Gemischte
Leukozytenreaktion: Messung der durch dendritische Zellen induzierten
Sekretion von IFNγ durch
T-Lymphozyten
- All diese Ergebnisse verdeutlichen die
wichtige Rolle der PPARs bei der LPC-induzierten Reifung der dendritischen
Zellen, ebenso wie die Wichtigkeit des PPARγ/PPARδ-Verhältnisses
bei der Produktion von funktionell reifen, dendritischen Zellen.
Dieses Verhältnis
wird durch LPC und Ciglitazon moduliert.
-
Beispiel 7 – Differenzierung
von Monozyten in reife dendritische Zellen in Gegenwart von LPC-äquivalenten Verbindungen
-
Die
Erfinder bestimmten, ob Verbindungen, die zu LPC äquivalent
sind, das heißt
Verbindungen, bei denen für
die gleichen zellulären
Wirkungsmechanismen die gleichen Membran- oder intrazellulären Rezeptoren
beteiligt sind, ebenfalls die Differenzierung der Monozyten in reife
dendritische Zellen induzieren konnten.
-
Hierzu
untersuchten die Erfinder, ob die Hinzufügung von PAF zu dem Kulturmedium
die Wirkung von LPC auf die Differenzierung von Monozyten in reife
dendritische Zellen erhöhen
konnte.
-
Daher
wurde eine Lösung
aus PAF (Sigma, 5 μM)
am 5. Tag der Monozytendifferenzierung zu dem Kulturmedium hinzugefügt. Die
Expression von CD86 durch die „Kontroll"-Zellen und die „LPC"-Zellen, welche in
Gegenwart oder in Abwesenheit von PAF erhalten wurden, wurde gemäß dem in
Beispiel 2 beschriebenen Protokoll analysiert, und die Ergebnisse
sind in der Tabelle 9 wiedergegeben. TABELLE
9 – Expression
des CD86-Markers (mittlere Fluoreszenzintensität) durch die „Kontroll"- und „LPC"-Zellen in Gegenwart
oder in Abwesenheit von PAF
- Diese Ergebnisse legen nahe, dass PAF alleine
eine leichte Überexpression
von CD86 induziert, anders als LPC, das einen 470%igen Anstieg in
der CD86-Expression induziert. Auf der anderen Seite ist es wichtig
zu bemerken, dass PAF in Synergie mit LPC wirkt, da die Wirkung
der beiden Verbindungen einen 1200%igen Anstieg in der CD86-Expression
induziert.
-
Um
die Idee, dass der PAF-Rezeptor beteiligt ist, zu bekräftigen,
untersuchten die Erfinder die Wirkung eines Antagonisten für diesen
Rezeptor auf die Differenzierung der Monozyten in reife dendritische
Zellen durch LPC.
-
Daher
wurde eine Lösung
des PAF-Antagonisten BN52021 (Biomol, Plymouth Meeting, USA, 100 μM) am 5.
Tag der Monozytendifferenzierung zu dem Kulturmedium hinzugefügt. Die
Expression von CD86 durch die „Kontroll"- und „LPC"-Zellen, die in Gegenwart
oder in Abwesenheit von BN52021 gewonnen wurden, wurde gemäß dem in
Beispiel 2 beschriebenen Protokoll analysiert und die Ergebnisse
sind in Tabelle 10 wiedergegeben. TABELLE
10 – Expression
von CD86 durch die „LPC"-Zellen in Gegenwart
des Antagonisten BN52021
- Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Wirkung
von LPC eindeutig den PAF-Rezeptor involviert, sie legen jedoch
auch nahe, dass bei der Wirkung von LPC auch andere Rezeptoren beteiligt
sein könnten.
-
Die
Erfinder zeigten also, dass der Antagonist BN52021, der zu dem Kulturmedium
am 5. Tag der Differenzierung der Monozyten in reife dendritische
Zellen hinzugefügt
wurde, welche durch oxidierte LDLs induziert wurden, eine 100%ige
Inhibierung der Wirkung der oxidierten LDLs induzierte, was hier
wiederum nahelegt, dass die Wirkungsmechanismen von LPC und von
oxidierten LDLs unterschiedlich sind.
-
Beispiel 8 – In vivo-Stimulation
der Immunantwort gegen ein Antigen durch LPC
-
Das
Ziel dieses Beispiels ist es zu zeigen, dass LPC ein Molekül ist, das
ein Adjuvans des Immunsystems ist, und das im Kontext einer Immunisierung
verwendet werden kann, um die spezifische T-Antwort gegen ein Antigen
zu steigern.
-
LPC
ist ein entzündliches
Produkt – In
diesem Beispiel wurde eine Lösung
aus 100 bis 500 nmol LPC, gelöst
in 50 μl
PBS, in den Fußballen
von BALB/c-Mäusen
(Charles River Laboratories) am Tag 0 injiziert. Die Fußballen
werden mit einem Mikrometer vor und nach der Injektion gemessen,
und zwar bis zum 10. Tag, sowie anschließend mit den Fußballen
der „Kontroll"-Mäuse verglichen,
die durch Injektion mit PBS (50 μl)
erhalten wurden. Die Entzündungsintensität wird durch
die Schwellung des Fußes
reflektiert. Die maximale Schwellung wird am 1. Tag beobachtet,
24 Stunden nach der Injektion. Tabelle
11 – Entzündung des
Fußballens,
induziert durch LPC-Schwellung
des Fußes
nach 24 Stunden (in mm)
- Diese Ergebnisse zeigen, dass LPC eine
Entzündung
induziert, und zwar in Abhängigkeit
von der injizierten Dosis.
-
Um
zu zeigen, dass LPC die Reifung und daher die Migration der dendritischen
Zellen in die Lymphknoten in vivo induziert, wurde eine LPC-Lösung (0,1
M in Dibutylphthalat) auf die Haut der Ohren der BALB/c-Mäuse (Charles
River Laboratories) aufgetragen, und zwar 10 Minuten vor Auftragung
einer FITC-Lösung
(Sigma) mit 1,5% in 1:1 Dibutylphthalat/Aceton. Dieser fluoreszierende
Marker wird durch die dendritischen Zellen der Haut aufgenommen.
Nach 24 Stunden werden die Ohr- und
Kiefer-Lymphknoten entfernt und die Zellen in eine Suspension gegeben.
Die Zellsuspension wird durch eine Metrizamid-Gradientenzentrifugation
(Sigma) hinsichtlich dendritischer Zellen angereichert. Die Zellen
werden mit einem Antikörper
(Pharmingen) markiert, der die Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes
(major histocompatibility complex, MHC) erkennt, und anschließend ermöglichte
es die Analyse durch Flusszytometrie, den Prozentsatz der großen Zellen
(dendritischen Zellen) zu quantifizieren, die MHC-Klasse II-Moleküle exprimieren
und die FITC aufweisen. Diese Zellen stellen Zellen dar, die das
FITC in der Peripherie aufgenommen haben, und die in die Lymphknoten
gewandert sind. Tabelle
12 – Stimulation
der dendritischen Zell-Migration durch LPC
- Diese Ergebnisse zeigen, dass die Auftragung
von LPC die Wanderung der dendritischen Zellen der Haut in die Lymphknoten
stimuliert.
-
LPC
stimuliert die T-Antwort, spezifisch für ein co-injiziertes lösliches
Antigen. LPC, gelöst
in PBS (250 oder 500 nmol in 50 μl)
wird mit Hühnerei-Lysozym
(HEL, 50 Mg) gemischt und anschließend wird diese Mischung in
den Fußballen
von BALB/c-Mäusen injiziert.
Nach 7 Tagen werden die Lymphknoten entfernt und deren Zellen dreifach
in vitro restimuliert, und zwar in einem Kulturmedium mit 30 μM HEL-Antigen oder in Abwesenheit
von HEL. Nach 3 Tagen wurde die T-Lymphozytenproliferation durch Einbau
von pulverisiertem Thymidin über
16 Stunden hinweg gemessen. Tabelle
13 – Proliferation
von HEL-spezifischen T Zellen (Einbau von pulverisiertem Thymidin
in CPM; Mittelwert der Dreifachansätze)
- Diese Ergebnisse zeigen, das LPC, co-injiziert
mit dem Antigen, die Aktivierung von T-Lymphozyten in vivo fördert, die
für dieses
Antigen spezifisch sind.
-
LPC
stimuliert die Produktion von spezifischen Antikörpern gegen ein co-injiziertes
lösliches
Antigen. LPC, gelöst
in PBS (350 nmol in 50 μl)
wird mit Hühnerei-Lysozym
(HEL, 1 mg/ml) gemischt, und anschließend wird diese Mischung in
den Fußballen
von BALB/c-Mäusen
injiziert. Die „HEL
+ LPC"-Gruppe der
Mäuse erhielt
50 μl dieser
Mischung in die Fußballen
der beiden Hinterfüße. Die „HEL"-Gruppe der Mäuse erhielt
50 μl der
HEL-Lösung
(1 mg/ml in PBS) in die beiden Füße. Nach
15 Tagen wurde in die zwei Flanken subkutan eine "Wiederholungs"-Injektion verabreicht.
Die „HEL
+ LPC"-Gruppe erhielt,
auf jeder Seite der Beine, 100 μl
einer Lösung
an LPC (5 mM) und an HEL (1 mg/ml) in PBS. Die „HEL"-Gruppe erhielt, an jeder Seite der
Beine, 100 μl
einer Lösung
aus HEL (1 mg/ml in PBS. Nach zwei Wochen wurde den Mäusen Blut
entnommen, und die IgGs, die spezifisch für das HEL-Antigen waren, mittels
ELISA hinsichtlich einem Standard-IgG-Lösungsbereich analysiert. Die
Titrationskurven, die die Absorption (Abs) als Logarithmusfunktion
der Serumverdünnungen
darstellen, sind in 1 dargestellt.
-
Diese
Ergebnisse legen nahe, dass LPC, co-injiziert mit dem Antigen, die
Aktivierung des Immunsystems fördert,
und die Synthese von Antikörpern
induziert, die für
das Antigen spezifisch sind, wohingegen eine Injektion des Antigens
alleine keine Antwort induziert. LPC induziert eine humorale Antwort
gegen das Antigen, wodurch seine Adjuvans-Fähigkeit unterstrichen wird.
-
LPC
kann eine CD8+ T-Lymphozytenantwort in vivo
induzieren. In diesem Beispiel wurde ein Test für eine verzögerte Kontakt-Hypersensitivität für Haptene
eingesetzt. Bei diesem Modell werden BALB/c-Mäuse durch Einsatz eines Haptens,
nämlich
DNFB (1-Fluor-2,4-dinitrobenzol, 0,5% Lösung in 1:1 Olivenöl/Aceton) im
Rücken
sensitiviert. Fünf
Tage später
wurde eine nicht-irritierende Dosis DNFB (0,2% Lösung in 1:1 Olivenöl/Aceton)
auf das linke Ohr aufgetragen, auf das rechte Ohr hingegen lediglich
das Lösungsmittel.
In dieser Reizungsphase werden CD8+-T-Lymphozyten,
die spezifisch für
die haptenisierten Proteine sind, rekrutiert und diese wandern anschließend in
das Ohr ein, wobei gleichzeitig IFNγ sekretiert und ein Ödem produziert
wird.
-
Eine „Kontroll"-Gruppe der Mäuse wurde
mit DNFB alleine sensitiviert, eine andere Gruppe („LPC"-Mäuse) erhielten
500 nmol LPC durch Auftragung auf die Haut des Rückens mit 20 μl einer ethanolischen
Lösung
von LPC, und zwar 10 Minuten vor der Auftragung von DNFB. Fünf Tage
später
wurden die zwei Gruppen auf die gleiche Art und Weise für die Reizungsphase
behandelt, und ein Anschwellen der Ohren wurde unter Verwendung
eines Mikrometers 48 Stunden nach der Auftragung gemessen. Tabelle
14 – Ausmessung
des Ohrödems
- Diese Ergebnisse zeigen, dass das Auftragen
des LPC 10 Minuten vor dem Hapten während der Sensitivierungsphase
das Öden
steigern lässt,
welches während
der zweiten Auftragung des Haptens (Reizung) induziert wurde. Dies
bedeutet, dass LPC die Antwort stimuliert, die durch die CD8+-T-Lymphozyten weitergegeben wird.
-
Beispiel 9 – Wirkung
einer Lipidemulsion, wie beispielsweise Intralipid®, auf
die Differenzierung von Monozyten in reife dendritische Zellen
-
Da
in Beispiel 5 gezeigt werden konnte, dass eine Lipidemulsion wie
beispielsweise Intralipid® die LPC-induzierte Produktion
reifer dendritischer Zellen blockiert, untersuchten die Erfinder
ferner, ob diese Blockierung von einer indirekten Wirkung dieser
Lipidemulsion über
die Inhibierung der Wirkung des LPC herrührt und/oder von einer direkten
Wirkung dieser Lipidemulsion.
-
Intralipid
® reguliert
PPARs in vitro. Zunächst
wurde eine Intralipid
®-Lösung (50 μg/ml Phospholipide) am 5. Tag
der Monozytendifferenzierung zu dem Kulturmedium hinzugefügt, und
zwar gemäß einem
Protokoll, das zu dem in Beispiel 6 beschriebenen vergleichbar ist.
Die Zellen wurden nach 1 h, 2 h oder 8 h Inkubation mit Intralipid
® geerntet,
die nucleären
Proteine wurden extrahiert und die Aktivität von PPARγ und PPARδ wurde, wie in Beispiel 6 beschrieben,
bestimmt. Tabelle
15 – Modulierung
der Aktivität
von PPARγ und
PPARδ der
eine Differenzierung unterlaufenden Monozyten durch Intralipid
® - Diese Ergebnisse zeigen, dass Intralipid® allein
PPARγ aktiviert
und die Aktivität
von PPARδ inhibiert.
Diese Wirkung von Intralipid® ist derjenigen von LPC
entgegengesetzt.
-
Als
nächstes
wurde eine Lösung
von Intralipid
® (50 μg/ml Phospholipide)
am 5. Tag der Monozytendifferenzierung zu dem Kulturmedium hinzugefügt, und
zwar 15 Minuten vor der Hinzufügung
einer LPC-Lösung (40 μM) („LPC +
Intralipid"-Zellen). „Intralipid"-Zellen wurden auch
in Abwesenheit von LPC erhalten. „LPC"-Zellen
wurden in Abwesenheit von Intralipid
® erhalten.
Die Zellen wurden nach 2 h Inkubation geerntet, die nucleären Proteine
extrahiert und die PPARγ-
und PPARδ-Aktivität, wie in
Beispiel 6 beschrieben, bestimmt. Tabelle
16 – Intralipid
® blockiert
die LPC-induzierte Generierung reifer dendritischer Zellen durch
Modulierung der Aktivität
von PPARγ und
PPARδ
- Intralipid® blockiert
auch die Wirkung von LPC durch Modulierung der Aktivität von PPARγ und PPARδ.
-
Intralipid
® blockiert
in vivo die durch LPC induzierte Entzündung und Immunantwort. In
diesem Beispiel wurden 3 Gruppen an BALB/c-Mäusen durch Injektion von 50 μl Lösung in
den Fußballen
gegen das Hühnerei-Lysozym(HEL)-Antigen
immunisiert. Die „HEL"-Kontrollgruppe erhielt
50 μg HEL,
die „HEL
+ Intralipid"-Gruppe
erhielt eine Mischung aus Intralipid
® (45 μl) und aus
50 μg HEL
(5 μl einer
Lösung
mit 10 mg/ml). Die „HEL
+ LPC"-Gruppe erhielt
50 μg HEL
mit 350 nmol LPC, gelöst
in PBS. Die „HEL
+ LPC + Intralipid"-Gruppe
erhielt 50 μg
HEL, gemischt mit 350 nmol LPC, gelöst in 45 μl Intralipid
®. Nach
24 Stunden wurde die Anschwellung der Fußballen unter Verwendung eines
Mikrometers gemessen und mit den Messungen verglichen, die vor der
Injektion vorgenommen wurden. Der Unterschied in der Schwellung
ist proportional zu der Intensität
der Entzündung. Tabelle
17 – Intralipid
reduziert in vivo die durch LPC induzierte Entzündung
- Diese Ergebnisse zeigen, dass die Injizierung
von Intralipid® zur
gleichen Zeit wie LPC die LPC-induzierte Entzündung des Fußballens
um 70% reduziert.
-
Sieben
Tage nach der Injektion werden die Kniekehlen-Lymphknoten entfernt
und deren Zellen in vitro dreifach restimuliert, und zwar in einem
Kulturmedium mit 10 μM
HEL oder in Abwesenheit von HEL. Nach 3 Tagen wurde die Proliferation
der HEL-spezifischen T-Lymphozyten durch Einbau von pulverisiertem
Thymidin über
16 Stunden hinweg gemessen. Tabelle
18 – Proliferation
der HEL-spezifischen T-Zellen (Mittelwert der Mäuse)
- Diese Ergebnisse zeigen, dass das zur gleichen
Zeit wie LPC ijizierte Intralipid® die
LPC-induzierte Stimulierung der T-Antwort blockiert
-
All
diese Ergebnisse zeigen, das Intralipid® die
LPC-induzierte Generierung reifer dendritischer Zellen durch eine
indirekte Wirkung des Intralipid® über eine
Inhibierung der Wirkung von LPC blockiert, jedoch auch über eine
direkte Wirkung von Intralipid auf PPARs, einem Antagonisten für LPC. Diese
Ergebnisse zeigen, dass Intralipid® alleine
eine entzündungshemmende
Rolle besitzt.
-
All
diese Ergebnisse zeigen die Wichtigkeit des PPARγ/PPARδ-Verhältnisses bei der Generierung funktionell
reifer dendritischer Zellen. Dieses Verhältnis wird durch LPC moduliert,
jedoch auch auf eine umgekehrte Weise durch eine Lipidemulsion,
wie beispielsweise Intralipid® oder Ciglitazon.